Application de l’approche fragmentale sur le récepteur protéine kinase VEGFR-2

La superfamille des protéines kinase est une cible intéressante pour l’industrie pharmaceutique. En effet, la fonction centrale de ces protéines concerne la transduction des signaux cellulaires chez tous les organismes et son disfonctionnement est à l’origine de pathologies graves comme le cancer, le diabète ou des maladies inflammatoires comme l’arthrite. Le site de liaison à l’ATP est localisé à l’interface entre deux lobes formant le repliement spécifique des protéines kinases. En 2001, le premier inhibiteur de protéine kinase s’administrant oralement, l’imatinib [199], a été approuvé contre la leucémie myéloïde chronique, prouvant ainsi qu’une poche à ATP conservée pouvait présenter une affinité particulière et être sélective envers une petite molécule. La structure de la protéine a été résolue et a révélé que la fixation de l’imatimib dans la poche à ATP provoque un

déplacement important de la phénylalanine dans le motif DFG qui développe une nouvelle poche. Alors que dans la conformation active, les deux poches sont connectées par une région charnière composée de résidus ayant un rôle crucial dans la liaison avec les ligands DFG-out Les modifications conformationnelles induites par l’imatinib rendent la structure inactive.

Dans cette étude, nous avons sélectionné la structure d’une protéine kinase DFG-out particulièrement étudiée, le récepteur VEGFR-2. La requête MED-SuMo soumise est représentée Figure 53)

Figure 53 : Représentation de la requête soumise à la base de MED-Portions.

Le site de liaison de la structure de la protéine kinase VEGFR-2 (code PDB : 2OH4). A. Représentation de la requête contenant les SCFs détectés dans un rayon de 10 Å autour du ligand. B. Représentation des triplets de SCFs

qui forment le graphe de la requête qui est comparé aux graphes de MED-Portions pré-compilés.

Le protocole décrit précédemment est utilisé pour générer des inhibiteurs DFG-out potentiels. Des hybrides 3D sont donc générés dans la poche DFG-out et seuls ceux contenant la sous-structure phénylamide du ligand GIG ont été gardés. Ce choix est important pour la génération de ligands DFG-out car ce groupement proche de la région charnière est uniquement observé dans les ligands se fixant au DFG-out. Il va donc induire un biais intéressant pour les hybrides générés sachant que nous voulons éviter de générer des ligands se fixant aux structures DFG-in. De plus, la base de MED-Portions contient à la fois les structures DFG-out et DFG-in ce qui est profitable car la région charnière est commune à ces

deux structures. Les MED-Portions extraites de DFG-in peuvent donc contribuer à la génération des hybrides DFG-out.

Apres le filtrage des hits, 1474 MED-Portions sont conservés (cf. Figure 54), parmi lesquels 25% proviennent de familles PFAM différentes des protéines kinases. Ce sont des

hits interfamilles. Ce pourcentage est important et ces hits influent sur les résultats de

l’hybridation.

Figure 54 : MED-Portions détectés par MED-SuMo.

En A. représentation des 1474 MED-Portions détectés par MED-SuMo. En B. MED-Portions détectés pour une requête comprenant toute la surface de la protéine.

L’analyse des châssis moléculaires (scaffold) des hybrides permet d’extraire 9000 molécules uniques dont 175 correspondent aux ligands de la PDB (19 ligands uniques). Le protocole mis en place permet donc la génération de ligands connus présents dans la PDB et plus particulièrement de 8000 nouveaux scaffolds non observés dans la PDB. 83 des 175 matches sont des ligands de protéine kinase tels GIG, L09, BMU, L10, 1PP, G2G, BAX, 2RL. La comparaison à une base de molécules (PubMed Compounds) détecte 549 matches (294 uniques) qui sont des molécules candidates intéressantes pour inhiber en conformation DFG-out. En parallèle, nous avons aussi recherché les hybrides générés dans une base de données des faux-positifs pour le VEGFR-2, la base DUD [200], seuls 2 scaffolds sont retrouvés (ceux des molécules : ZINC00341936 et ZINC00570337). Un faible taux de faux positifs est donc généré par notre approche. De manière intéressante, 27 matchs (dont 13

uniques) sont annotés comme actifs sur les protéines kinases, correspondant à 735 ligands des tests d’activité des protéines kinases de la PubChem. Ces ligands pourraient donc potentiellement être testés sur les protéines kinases connues pour se lier aux sites DFG-out.

Certains scaffolds sont retrouvés dans les tests d’activité des protéines kinases de la PubChem et pas dans la PDB. La plupart ont des différences mineures avec les ligands de la PDB tels qu’un O à la place d’un N dans une région liante, ou d’un N à la place d’un C dans un cycle aromatique. Le ligand correspondant au composé PubChem ayant l’identifiant CID=3527591 est particulièrement intéressant. Il est annoté comme inhibiteur de la protéine kinase FAK et contient une sous-structure benzohydrazide originale. Nos résultats suggèrent que cette molécule est un ligand DFG-out potentiel (cf. Figure 55 et Figure 56) ce qui nécessiterait naturellement d’être validé expérimentalement. De manière surprenante, une structure récemment déposée dans la PDB (3C1X) est une protéine kinase complexée avec le ligand DFG-out contenant un groupement malonamide [201]. Ce ligand est proche de notre hybride car il est différent de la fraction amide ou urée que nous retrouvons habituellement dans cette position dans les complexes issus de la PDB.

Figure 55 : Exemple d’hybrides obtenus avec le programme MED-Hybridize.

A-E : Structure de cinq hybrides contenant des scaffolds de la base « PubChem Compounds » comme par exemple la sous-structure ayant l’identifiant CID=3527591 représentée dans E.

Figure 56 : Molécule D de la Figure 55 représentée selon ses coordonnées 3D dans la requête 2OH4.

Cette molécule est une hybride de quatre MED-Portions extraits des fichiers PDB : 2HZ0, 2OH4, 1WBN, 3CTQ (toutes étant des structures de kinases DFG-out) combiné avec la sous-structure phénylamide initiale. Une minimisation énergétique sur la géométrie de l’hybride a permis la relaxation du groupement benzohydrazide. Une liaison hydrogène est détectée entre le groupement carbonyle de l’aspartate 1044 et le groupement benzohydrazide.

Conclusion

Nous avons développé un protocole complet et automatique pour le fragment-based

drug design permettant de générer des molécules de novo basées sur des informations

structurales de la PDB. Cette nouvelle méthode est une combinaison des trois techniques MED-Portions, MED-SuMo et MED-Hybridise. Elle se base sur la soumission d’une surface d’interaction requête afin de superposer des motifs protéine-fragment issus de la PDB. Les sous-structures chimiques sont ensuite exportés en gardant leurs coordonnées 3D dans le repère 3D de la protéine requête, et ensuite combinées pour former de nouveaux composés hybrides. Le programme MED-SuMo Fragmentor permet de générer un grand nombre de MED-portions, des complexes protéine-fragment extraits à partir des complexes protéine- ligand de la PDB se basant sur de réelles petites molécules chimiques. Le protocole peut être enrichi avec des données biostructurales propriétaires au format PDB. Toute autre chimiothèque peut aussi servir au protocole de fragmentation. Nous avons choisi la PubChem car d’une part elle regroupe un grand nombre de molécules réelles de fournisseurs différents et d’autre part certaines de ces molécules disposent d’annotations biologiques. L’objet MED- Portion est un concept nouveau qui contient une sous-structure chimique, des dummy atomes représentant les valences libres sur les fragments et les SCFs de MED-SuMo représentant les groupements chimiques de la surface de la protéine en interaction potentielle avec les atomes

du fragment. Combiné avec l’approche de MED-SuMo, ce protocole permet de remplir des surfaces d’interactions de protéines (sites de liaison, surfaces entières ou autres) par un ensemble de MED-Portions. L’application sur la protéine kinase VEGFR-2 permet de récupérer des scaffolds de ligands actifs connus. De plus, la structure d’une sous-structure potentiellement intéressante (phénylamide) est étendue par hybridation avec les MED- Portions obtenus jusqu'à la formation d’une molécule candidate. En détectant parmi les molécules hybrides celles directement disponibles dans une chimiothèque donnée, il devient possible d’acheter directement ces molécules candidates. Une application sur les GPCR a aussi été réalisée et a été publié récemment (Article 3, [17]).

158 Conclusion générale