Protein-protein interaction classes………... 200
Ubiquitin, HDAC6 and the proteasome and aggresome pathways………... 201
Overexpression of HDAC6-EGFP fusion proteins in HEK 293 cells and their interaction with recombinant mono-Ub measured by MST……….. 204
Chemical structure of the 40 compounds selected through VS and screened using both the MST and the ELISA assays……… 207
Microscale thermophoresis (MST) applied for the screening of HDAC6 ligands:
detection of binding on both catalytic and ZnF-UBP domains………. 211
ELISA-based method for measuring the inhibition of the protein-protein interaction (PPI) between HDAC6 and Ub……… 213
Ubiquitin binding pocket and its crystallographic configuration sampling……….. 215
Calibration curve for recombinant GFP (rGFP) and MS-based catalytic activity of HDAC6-EGFP fusion proteins in lysates of transfected HEK 293 cells………... 228
MST experiments with different batches of lysates diluted 2-, 4- and 8-fold indicated no significant competition between recombinant mono-ubiquitin and endogenous free ubiquitin or other Ub-like proteins………... 229
MST binding experiments with HDAC6-EGFP fusion proteins in lysates of HEK 293 cells and His6-ubiquitin (His6-Ub)………... 230
HDAC6-EGFP WT binds to mono-ubiquitin, K48-, and K63-linked polyubiquitin chains with similar affinities……… 231
Mono-ubiquitin binds to EGFP-HDAC6 WT with 50-fold higher affinity than the ubiquitin-like proteins NEDD8 and ISG15……….. 233
2D structures of biologically active compounds (197 and 211) selected from SBVS and positive/negative controls……… 235
Binding of recombinant full length HDAC6 WT to mono-Ub labeled with NT-647 using NHS coupling chemistry……… 236
HDAC6-ZnF-UBP Co-crystallized compounds structures……….. 236
Summary of the SBVS results……….. 237
Tables
Chapter 1. HDAC6, an exceptional enzyme among the histone deacetylase proteins family
Areas of flexibility detected in class I HDACs………. 13
Areas of flexibility detected in class II and IV HDACs……… 16
Epigenetic mechanisms and their respective involved protein families and domains…... 37
HDAC6 crystallographic structures available on the Protein Data Bank (PDB)……….. 38
HDAC6 partners and their demonstrated interacting domain(s)……….. 39
Chapter 2. HDAC inhibitors from diverse chemical libraries: looking for HDAC6 selectivity
HDAC inhibition of selected aurones in a nuclear extract and towards various isoforms 47
Activity profile of the seven best compounds from the aurones series………. 54
Percentage viability and HDAC inhibition of compounds 2, 3 and 17-36……… 77
Molecular docking and enzymatic results of 4,6-dihydroxylated aurones with the ring B replaced by an indole ring………. 80
Molecular docking and enzymatic results of aurones bearing a sulfonyl group………… 85
iv
Molecular docking and enzymatic results of 4,6-dihydroxylated aurones with a
hydroxylated ring B………. 85
Molecular docking and enzymatic results of 4,6-dihydroxylated aurones bearing alkyloxy-substituents on the ring B……….. 87
Molecular docking and enzymatic results of 4,6-dihydroxylated aurones bearing halogeno-substituents on the ring B………. 89
Molecular docking and enzymatic results of 4,6-dihydroxylated aurones bearing other substituents on the ring B………. 91
Molecular docking and enzymatic results of 6,7-dihydroxylated aurones………... 93
Molecular docking and enzymatic results of other types of aurone……….. 94
Molecular docking and enzymatic results of the 1,3,4-oxadiazole series………. 95
Molecular docking and enzymatic results of the chalcones and derivatives compounds series……… 97
Molecular docking and enzymatic results of the thiosemicarbazides series………. 99
Molecular docking and enzymatic results of pyrimidinetriones………... 101
Chapter 3. Rational design of HDAC6-selective inhibitors through a pharmacophore approach Enzymatic activity profile of the eight compounds selected from the virtual screening campaign……….. 113
Cytotoxic properties of AK-14………. 116
Number (N) of HDAC inhibitors (HDAC2, 4, 6, 8) retrieved from the ChEMBL search 131 The HDAC ChEMBL dataset……….. 132
Isoform selectivity (ratio) for the compounds selected for HDAC6 pharmacophore building……… 136
List of the 200 best-ranked compounds obtained with the pharmacophore based virtual screening approach……….. 136
List of the 200 best-ranked compounds obtained with the ligand based virtual screening approach………... 137
Forty compounds from the pharmacophore based and ligand-based virtual screening selected for in vitro testing………... 139
Pocket volumes of HDAC2, 8, 4 and 6 calculated through Connolly’s surface using CASTp server……….. 145
Chapter 4. Accounting for HDAC6 selectivity: flexibility and solvent-mediated arguments Summary of the molecular docking results for 180 and 181 conducted on HDAC isoform 2, 4, 6 and 8………. 154
Details about the interactions between 180, 181 and HDAC2, HDAC4, HDAC6, and HDAC8 best-ranked docking poses………. 156
The five loops surrounding the catalytic pocket of HDAC2, 4, 6 and 8……… 169
HDAC proteins taken into account in this study. Structural details……….. 196
Summary of the re-docking results for HDAC2, 4, 6, 8 complexes reported in the PDB 196 Average RMSD and distance values calculated from the MD trajectories of the eight complexes obtained by docking………... 197
Average number of water molecules occupying the first and the second solvation shell calculated from the MD trajectories of the eight complexes obtained by docking……… 197
Chapter 5. Addressing the modulation of HDAC6 – ubiquitin interaction Effect of selected hits on HDAC6 catalytic activity………. 245
HDAC6-ZnF-UBP co-crystallized compounds screening using the ELISA-based assay 245
v PREFACE
The Pharmacochemistry research group, directed by Pr. P.A. Carrupt, has long been dedicated to the development of original in vitro (Dr. G. Stezaert, 1998; Dr. G. Bouchart 2001; Dr. B. Bard, 2008, Y. Henchoz, 2009) and in silico (Dr. Zuaboni, 2008) tools and strategies to determine physico-chemical (lipophilicity, solubility, pKa) properties of new chemical entities (NCEs). Additionally, the permeation through the main human biological barriers (gastro-intestinal, blood-brain, and skin) of known drugs and chemicals, together with NCEs were predicted using parallel artificial membrane permeability assays (PAMPAs, Dr. M.E. Castella, 2005; Dr. G. Ottaviani, 2006; Dr. C. Le-Bourdonnec Passeleu, 2013; Dr. A. Bujard, 2015; Dr. C. Petit, 2016) and modeling (Dr. G. Ottaviani, 2006).
Lipophilicity is also a critical parameter in pharmacochemistry and drug development, and as such, has been another aspect investigated by the research group. A new descriptor was developed as a molecular interaction field: the molecular lipophilicity potential, MLP. Based on experimental LogP values, it enabled better description of lipophilicity in drug design projects (Dr. A. Galland, 2004; Dr.
A. Daina, 2006; Dr. N. Oberhauser, 2014) and in virtual screening approaches (Dr. A. Daina, 2006; Dr.
J. Bravo, 2009; Dr. N. Oberhauser, 2014).
Alongside the investigation of these important physico-chemical parameters, the Pharmacochemistry research group identified multi-target hits that inhibited enzymes involved in neurodegenerative disorders (monoamine oxidases, MAO, and acetylcholine esterase, AchE). In vitro (Dr. L. Novaroli, 2005; S. Di Givanni, 2006) and in silico (Dr. J. Bravo, 2009) strategies were successfully employed to discover natural and synthetic MAO or AchE inhibitors.
More recently, the research group has focused on the emerging field of epigenetics (Dr. L.
Ryckewaert, 2015, Dr. V. Zwick, 2016; Dr. L. Sacconnay 2016). The group has specialized on the histone deacetylase (HDACs) proteins family, investigating several classes (class I HDACs and class III HDACs, also called sirtuins) through computational and in vitro methods. Indeed this family of enzymes is involved in various diseases, including neurodegenerative disorders and cancer.
This manuscript reports the investigations on one specific HDAC isoform: the histone deacetylase 6. Using both in silico and in vitro techniques, it aims at getting insights into the molecular requirements to reach HDAC6 selectivity, at both the ligand and the protein structure levels, in the context of drug discovery.
vi SCIENTIFIC CONTRIBUTIONS
Publications
Aurones as histone deacetylases inhibitors: identification of key features, published in Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2014, 24, 5497-5501. Vincent Zwick±, Alkiviadis-Orfefs Chatzivasileiou±, Nathalie Deschamps±, Marina Roussaki, Claudia A. Simões-Pires, Alessandra Nurisso, Iza Denis, Christophe Blanquart, Nadine Martinet, Pierre-Alain Carrupt, Anastasia Detsi, Muriel Cuendet. ±: equal contribution.
How the flexibility of human histone deacetylases influences ligand binding - An overview, published in Drug Discovery Today, 2015, 20(6), 736-742. Nathalie Deschamps, Claudia A.
Simões-Pires, Pierre-Alain Carrupt, and Alessandra Nurisso.
A rational approach for the identification of non-hydroxamate HDAC6-selective inhibitors, published in Scientific Reports, 2016. Laura Goracci±, Nathalie Deschamps±, Giuseppe Marco Randazzo, Charlotte Petit, Carolina Dos Santos Passos, Pierre-Alain Carrupt, Claudia Simões-Pires and Alessandra Nurisso. ±: equal contribution.
Unravelling the structural elements governing the selective inhibition of HDAC6 by capless compounds: a computational study, to be submitted. Nathalie Deschamps, Carolina Dos Santos Passos, Benjamin Grenier, Pierre-Alain Carrupt, Claudia Simões-Pires and Alessandra Nurisso.
Methods for addressing the protein-protein interaction between histone deacetylase 6 and ubiquitin, submitted in Communications Biology 2017. Carolina dos S. Passos±, Nathalie Deschamps±, Yun Choi, Robert E. Cohen, Remo Perozzo, Stephen W. Michnick, Alessandra Nurisso and Claudia A. Simões-Pires. ±: equal contribution.
Oral communications
A rational approach for the identification of non-hydroxamate HDAC6-selective inhibitors. 24th SCT Young Research Fellow Meeting, February 8-10th 2017, Paris-Sud University, France.
Addressing the HDAC6-Ubiquitin protein-protein interaction. PhD day, June 6th 2017, Louis-Jeantet Fundation, Geneva, Switzerland.
Posters
Aurones as histone deacetylases inhibitors: identification of key features. Vincent Zwick±, Alkiviadis-Orfefs Chatzivasileiou±, Nathalie Deschamps±, Marina Roussaki, Claudia A.
Simões-Pires, Alessandra Nurisso, Iza Denis, Christophe Blanquart, Nadine Martinet, Pierre-Alain Carrupt, Anastasia Detsi, Muriel Cuendet. Swiss Pharma Day, August 2013, Bern, Switzerland.
Capless compounds can inhibit HDAC6 selectively. Nathalie Deschamps, Carolina Dos Santos Passos, Pierre-Alain Carrupt, Claudia Simões-Pires and Alessandra Nurisso. 23rd International Symposium on Medicinal Chemistry, EFMC-ISMC 2014, Lisbon, Portugal.
vii
A rational approach for the identification of non-hydroxamate HDAC6-selective inhibitors. Laura Goracci±, Nathalie Deschamps±, Giuseppe Marco Randazzo, Charlotte Petit, Carolina Dos Santos Passos, Pierre-Alain Carrupt, Claudia Simões-Pires and Alessandra Nurisso. Journées Scientifiques du Médicament, June 2017, Grenoble, France.
viii ACKNOWLEDGEMENTS
Ces cinq années de thèse ont été ponctuées de nombreuses rencontres, toutes ont enrichi cette expérience, que ce soit sur le plan humain ou sur le plan scientifique.
En tout premier lieu, je souhaite adresser ma plus profonde reconnaissance au Pr. Pierre-Alain Carrupt. En acceptant ma candidature spontanée, il m’a donné l’incroyable opportunité de faire cinq années de recherche passionnante, et de devenir, par la suite, docteure. Malgré son départ anticipé, je souhaite le remercier d’abord pour ses conseils scientifiques et ses encouragements, mais aussi pour les excellents moments partagés.
Ensuite, je souhaite remercier chaleureusement le Dr. Alessandra Nurisso. C’est grâce à elle que j’ai pu rejoindre le laboratoire de pharmacochimie ; elle est la première à avoir cru en moi. En me faisant partager sa recherche et ses compétences, elle m’a permis de mûrir en tant que scientifique.
J’adresse également ma profonde reconnaissance au Dr. Claudia Avello Simões-Pires. Toujours souriante, dynamique et disponible, elle a su me conseiller, me motiver et me soutenir à chaque nouveau projet. En devenant mes co-directrices, les Drs. Alessandra Nurisso et Claudia Avello Simões-Pires m’ont impliquée dans des projets passionnants en me poussant toujours vers l’excellence. Elles m’ont énormément apporté, autant scientifiquement qu’humainement. Je pense, en particulier, à toutes ces discussions informelles autour du café de 9h. Plus qu’une co-direction, nous avons formé une véritable équipe, et pour cela je souhaite leur dire un immense merci.
J’adresse au Pr. Jean-Luc Veuthey ma sincère reconnaissance. En acceptant de reprendre la direction de ma thèse après le départ du Pr. Carrupt, il m’aura permis de terminer ces cinq années de recherche dans les meilleures conditions. Je lui suis particulièrement reconnaissante de m’avoir intégrée à son groupe, mais aussi pour son écoute et ses conseils. J’ai été soutenue jusqu’au bout, et c’est aussi grâce à lui.
Parmi toutes les personnes m’ayant apporté leur soutien, je n’oublie pas Sylvia Passaquay-Rion.
Elle a toujours été présente, que ce soit grâce à son excellente gestion de mon dossier, que par son sourire et ses encouragements. Elle s’est toujours souciée de moi et m’a toujours apporté son aide avec bienveillance.
Je souhaite aussi remercier très chaleureusement l’équipe du Service égalité. Par l’attribution du Subside Tremplin 2017, ils m’ont permis de terminer ma thèse sereinement. Je remercie également la Pr. Frauke Müller pour son appui, toujours positif.
I would like to warmly thank all the jury members for being present and taking time to review my work: Pr. Ahcène Boumendjel, Dr. Yves Auberson and Pr. Patrycja Nowak-Sliwinska. I met each one of you either during my pharmacy studies, at the very beginning of my PhD thesis or later, and I have always appreciated our scientific discussions.
Je souhaite maintenant remercier tous les anciens membres du groupe Pharmacochimie pour tous les échanges et les bons moments passés ensemble : Dr. Alban Bujard, Dr. Stéphanie Romand, Dr.
Céline Le Bourdonnec-Passeleu, Christophe Francey, Fabrice Gillerat, Dr. Florine Lecerf-Schmidt, Dr.
Nils Oberhauser, Emilie Reginato, Dr. Sophie Martel, Virginie Beyeler, Laurent Starrenberger, Dr.
ix Carolina Dos Santos Passos, Dr. Marco Randazzo, et Dr. Julietta Gradinaru. Mais j’ai une pensée toute particulière pour les Drs. Lucie Ryckewaert et Charlotte Petit. Lorsque je suis arrivée dans l’équipe, vous aviez déjà bien avancé vos thèses. Très vite, pourtant, vous m’avez intégrée et même adoptée.
Comment oublier ces longues heures passées ensemble au laboratoire, nos discussions scientifiques, culturelles ou complètement décalées autour d’un verre, nos motivations et démotivations, votre visite à la maternité, nos fou-rires. Vous étiez mon rayon de soleil au laboratoire, vous êtes devenues parmi mes plus proches amies. Je n’oublie pas le Dr. Lionel Saconnay avec qui j’ai partagé un bureau pendant plus d’une année. Nous nous sommes toujours entraidés sur les projets de modélisation moléculaire.
Même après avoir rejoint son nouveau poste, je lui suis très reconnaissante d’avoir continué à être un soutien.
Je n’oublierai pas non plus les moments passés avec la "team théâtre" avec qui j’ai eu quelques-uns de mes meilleurs fou-rires : Chiara Ambuehl, Dr. Stéphanie Romand, Dr. Lucie Ryckewaert, Dr.
Charlotte Petit, Dr. Florine Lecerf-Schmidt et Dr. Céline Passeleu – Le Bourdonnec. Mais aussi la "team running" commencée avec le Dr. Philippe Eugster, Dr. Leonardo Lauciello et Dr. Alessandra Monaco, puis avec Dr. Lucie Ryckewaert et Dr. Charlotte Petit, complétée enfin avec Aymeric Monteillier, Noémie Saraux, Léonie Pellissier et Antonio Azzollini.
Je pense maintenant aux membres de mon laboratoire d’adoption (Sciences analytiques) : Cédric Schelling, Christophe Francey, Jessica Ortelli, Emilie Reginato, Vida Sadat-Noorbakhsh, Aline Mutabazi, Arnaud Garcia, Nicolas Drouin, Yoric Gagnebin, Julian Pezzati, Vincent Desfontaine, Alexandre Goyon, Dr. Aline Dellicour, Dr. Marco Randazzo, Dr. Victor Gonzalez-Ruiz, Dr. Valentina D’Atri, Dr. Olivier Ciclet, Dr. Balazs Bobaly, Dr. Sabolcs Fekete, Dr. Julien Boccard, Dr. Julie Schappler, Dr. Davy Guillarme, Nicole Decrey et Pr. Serge Rudaz. Ils m’ont très vite intégrée au sein du groupe et je garderai beaucoup de souvenirs de discussions (non scientifiques) mémorables de la pause de midi !
Enfin, je tiens à remercier toute l’équipe d’encadrement des travaux pratiques où l’ambiance était toujours bon enfant : Dr. Davy Guillarme, Dr. Remo Perozzo, Pr. Leonardo Scapozza, Dr. Elisabeth Rivara-Menten, Elinam Gayi, Verena Santer, Dr. Stéphanie Romand, Dr. Charlotte Petit, Francesca Tessaro, Léonie Pellissier, Dr. Marco Randazzo, Micaela Freitas et Dr. Emmanuel Varesio. Avec un remerciement spécial au Dr. Sébastien Tardy pour son implication, et surtout pour l’arrivée du mégaphone qui nous aura valu des moments cocasses !
Plus personnellement maintenant, je souhaite dédier cette thèse à Marie et Dominique pour leur soutien indéfectible. Sans eux, rien de tout ceci n’aurait été possible. Je pense aussi aux petits et grands messages, aux soirées et aux week-ends off avec mes plus proches amis : Marion, Lydie, Boris, Isa, Hélo, Jérémie, Aurélie, Alex, Etienne, Sandy, Thomas et Alice.
Mais surtout, je dédie ces cinq années de travail à Ludovic et à Margot, qui, sans toujours le savoir, ont apporté leur contribution à chacun des chapitres de cette thèse.
x RÉSUMÉ DE LA THÈSE
La recherche fondamentale et pharmaceutique dans le vaste domaine de l’épigénétique a explosé ces dix dernières années. Au début de l’année 2017, quarante-six molécules étaient en phase d’essais cliniques, et huit autres avaient déjà été approuvées par les autorités compétentes, témoignant, ainsi, du dynamisme de ce secteur de recherche. L’immense majorité de ces candidats médicaments ont une visée anticancéreuse. En effet, l’étymologie du mot épigénétique signifie autour et au-dessus de la génétique, c’est-à-dire les processus qui régulent l’accès et l’expression des gènes sans modifier leur séquence nucléotidique. Les mécanismes épigénétiques font intervenir plusieurs types de domaine protéique et plusieurs familles d’enzyme. Parmi ces dernières, la famille des histone déacétylases (HDACs) fait l’objet d’un intérêt particulier. Les HDACs catalysent, entre autres, la déacétylation de certaines lysines spécifiques sur les histones, des protéines globulaires permettant l’organisation compacte de l’ADN en chromatine. Par ailleurs, les localisations tissulaire et cellulaire de ces enzymes sont variées : les isoformes de la classe I (HDACs 1-3, et 8) sont très majoritairement nucléaires, les isoformes des classes IIa et IV (HDACs 4, 5, 7, 9, et 11, respectivement) naviguent entre le cytosol et le noyau, alors que les isoformes de la classe IIb (HDACs 6 et 10) sont principalement cytosoliques. Cependant, cette famille enzymatique a bien d’autres substrats et partenaires, donnant lieu à des rôles dans la maturation neuronale, l’immunité, le cycle cellulaire en général, ou bien encore dans l’infection par certains virus.
Du fait de cette diversité, les HDACs sont impliquées dans divers processus pathologiques. Le plus documenté étant l’oncologie, et plus particulièrement les cancers hématologiques.
Il existe, à l’heure actuelle, quatre médicaments autorisés ayant pour cible les HDACs pour le traitement de seconde ou troisième intention des lymphomes cutanés et du myélome multiple (vorinostat, Zolinza® - Merck, 2006 ; romidepsin, Istodax® - Celgène, 2009 ; belinostat, Beleodaq® - Spectrum Pharmaceuticals ; et panobinostat, Farydak® - Novartis, 2015). Ces médicaments sont autorisés aux Etats Unis d’Amérique, mais font l’objet d’un statut de médicament orphelin ou d’autorisation temporaire d’utilisation en Europe, sauf pour le Farydak® dont le niveau SMR (service médical rendu) est jugé modéré. Quoi qu’il en soit, les quatre principes actifs de ces médicaments suivent tous le même schéma structural. Ils sont composés, sur le plan chimique, de trois segments : le premier comporte un groupe fonctionnel capable de chélater le zinc catalytique du site actif des HDACs (localisé au fond du site actif), le second est un segment de connexion, souvent hydrophobe, pour occuper le site actif en forme de tunnel, et enfin le troisième segment est un motif de taille et de composition variable que l’on appelle le groupe « chapeau », car il occupe la surface du site actif. Ce dernier segment est jugé responsable de la sélectivité entre les isoformes de la famille HDACs. Bien que présentant une avancée pour les patients, via une re-sensibilisation des cellules tumorales au chimiothérapie conventionnelles, ils montrent des faiblesses en termes de pharmacocinétique et d’effets indésirables (fatigue profonde, nausées et vomissements dose-limitants, toxicités cardiaque et hématopoïétique). Par ailleurs, ces inhibiteurs ciblent la famille des HDACs sans discrimination, et leurs effets indésirables ont été récemment attribués à l’inhibition des isoformes de la classe I. Aussi est-il critique de développer de nouvelles molécules plus sélectives. Le défi proposé est grand car les sites actifs de ces enzymes présentent un haut niveau d’homologie.
Cependant, l’isoforme 6 fait figure d’exception. Sa structure (1215 acides aminés, deux domaines catalytiques en tandem, et un domaine en doigt de zinc), sa localisation cellulaire, et ses partenaires (aussi bien enzymatiques que non-enzymatiques), font d’elle une protéine unique au sein de la famille des déacétylases. HDAC6 a, entre autres protéines associées, la chaperone HSP90,
l’α-xi tubuline et la cortactine pour substrats, et l’ubiquitine comme partenaire d’interaction protéine-protéine.
HDAC6 joue donc un rôle majeur dans la dégradation des protéines mal repliées (voies du protéasome et de l’aggrésome), dans la mobilité cellulaire, et dans la régulation de certains processus immunitaires (lymphocytes T régulateurs). Du fait de son profil exceptionnel, tant sur le plan structural que sur le plan biologique, l’intérêt de l’inhibition sélective d’HDAC6 a peu à peu émergé. En 2011, le premier essai clinique (de phase I et IIa) avec un inhibiteur catalytique sélectif, ACY-1215, était lancé, avec pour objectif son étude en combinaison avec un inhibiteur du protéasome chez des patients atteints de myélome multiple, réfractaire ou en rechute. La structure d’ACY-1215 suit le schéma classique pour
HDAC6 joue donc un rôle majeur dans la dégradation des protéines mal repliées (voies du protéasome et de l’aggrésome), dans la mobilité cellulaire, et dans la régulation de certains processus immunitaires (lymphocytes T régulateurs). Du fait de son profil exceptionnel, tant sur le plan structural que sur le plan biologique, l’intérêt de l’inhibition sélective d’HDAC6 a peu à peu émergé. En 2011, le premier essai clinique (de phase I et IIa) avec un inhibiteur catalytique sélectif, ACY-1215, était lancé, avec pour objectif son étude en combinaison avec un inhibiteur du protéasome chez des patients atteints de myélome multiple, réfractaire ou en rechute. La structure d’ACY-1215 suit le schéma classique pour