O desenvolvimento de sistemas de expressão eficientes é essencial para a exploração do potencial dos anticorpos, quer em termos de eficácia quer em termos dos custos inerentes à produção dos mesmos [64]. A expressão de anticorpos funcionais, com o enrolamento correto e possíveis de aplicar a uma escala industrial é o objetivo primário no desenvolvimento de anticorpos terapêuticos. Uma vez que as terapias baseadas na utilização de anticorpos requerem largas doses de anticorpos durante longos períodos de tempo, a capacidade de produção tornou-se um problema, na medida em que o biofármaco deve ser produzido em grandes quantidade e com um custo e tempo de produção eficientes, de forma a enquadrar-se nos requisitos clínicos [65].
As células de mamíferos apresentam-se como o sistema de expressão de eleição para a produção de mAbs em larga escala, e o seu sucesso é maioritariamente devido à sua capacidade de produzir mAbs bioquimicamente similares à forma humana, uma vez que produzem anticorpos com a estrutura, o enrolamento e as modificações pós-traducionais corretas. Para além disso, estas são ainda capazes de se adaptarem a culturas em bioreatores de larga escala, produzindo elevadas quantidades de anticorpos com qualidade consistente [52]. Em particular, a linha celular obtida a partir de ovário de hamster chinês (CHO) são a linha celular mais vastamente utilizada para a produção de
mAbs em larga escala [66]. Estas células foram isoladas pela primeira vez em 1958 por Joe-Hin Tjio et al. e rapidamente ganharam reconhecimento devido à sua facilidade e rápido tempo de cultura [67]. Atualmente, esta linha celular consiste no hospedeiro de produção de aproximadamente 70% de todas as proteínas terapêuticas recombinantes [68]. A sua ampla utilização como veículo principal de produção de mAbs está relacionada com diversas razões, nomeadamente: demonstraram segurança ao longo de duas décadas, o que facilita a obtenção de aprovação por parte de agências reguladoras como a FDA [54]; são passíveis de se aplicarem técnicas de amplificação genética, tal como a utilização da di-hidrofolato redutase (DHFR) ou a glutamina sintase (GS), que permitem atenuar a baixa produtividade específica que dificulta a produção de proteínas recombinantes em células de mamíferos [68, 69]; possuem o repertório molecular adequado para a ocorrência de modificações pós-traducionais semelhantes à nativa com glicoformas comparáveis às dos humanos, exibindo, consequentemente, atividade molecular semelhante [70]; crescem adequadamente em culturas em suspensão isentas de soro, muitas vezes em bioreatores de aço inoxidável ou mesmo descartáveis [71]; é possível o seu aumento de escala [70]. Existem ainda vantagens adicionais que fundamentam o grande sucesso desta linha celular, nomeadamente o facto de vírus patogénicos humanos, tais como o HIV, influenza e polio, não replicarem em células CHO, aumentando a segurança dos mAbs produzidos e consequentemente resultando num processo de purificação mais simples [72], e o facto de serem facilmente modificadas geneticamente para otimização do processo de produção [54].
Seguidamente às células CHO, as linhas celulares mais utilizadas para a produção de mAbs são as células linfoides de murino NS0 e SP2/0, uma vez que são originadas a partir de células B diferenciadas que produzem elevadas quantidades de Igs. Contudo, estas não são a cultura celular principal para a produção de mAbs pois os anticorpos que estas produzem podem conter resíduos imunogénicos, resultando num tempo de meia-vida reduzido quando administrados in vivo [73]. A utilização de células de fontes humanas é uma opção que permite eliminar a presença de grupos antigénicos nos anticorpos produzidos. Existem atualmente várias possibilidades que estão a ser estudadas, nomeadamente as células embrionárias humanas derivadas do rim HEK293, os amniócitos humanos imortalizados da CEVEC e as células embrionárias humanas derivadas dos retinoblastos PER.C6 da Crucell [74]. Embora as HEK293 e os amniócitos estejam reportados como sendo os mais adequados para a produção de proteínas, as PER.C6 são consideradas como as candidatas mais promissoras uma vez que são as mais
produtivas e que podem atingir densidades celulares 10 vezes superiores às células CHO, produzindo mais de 27 g/L de proteína em reatores [74, 75]. Embora as linhas celulares humanas estejam ainda sujeitas a problemas de regulamentação devido à sua baixa resistência contra agentes adventícios, vários produtos derivados das PER.C6 encontram- se atualmente na fase de ensaios clínicos [74].
A seleção do sistema de expressão adequado é determinada pela sua capacidade de: i) produzir elevadas concentrações do bioproduto, ii) produzir consistentemente os anticorpos com as características desejadas (como por exemplo o padrão de glicosilação), iii) atingir um elevado rendimento da linha celular e iv) crescer em suspensão [52]. Linhas celulares altamente produtivas resultam da utilização de uma linha celular hospedeira com as características desejadas, um sistema de expressão apropriado e um protocolo de transfeção e seleção adequado. Assim sendo, no que concerne ao processo de desenvolvimento de linhas celulares, este inicia-se com a transfeção das células mamíferas com vetores plasmídicos, contendo os genes das cadeias leves e cadeias pesadas do anticorpo de interesse e ainda genes marcadores de seleção, que permitem a seleção das células transfetadas conferindo resistência a determinados antibióticos ou vantagens no crescimento/desenvolvimento em condições deficientes em determinados nutrientes [76]. No caso das células CHO DG44 ou DXB11 deficientes na enzima dihidrofolato redutase (DHFR), utiliza-se um marcador DHFR que confere a capacidade de reduzir o dihridrofolato a tetrahidrofolato, um metabolito necessário para o metabolismo dos ácidos nucleicos, permitindo então que apenas as células que incorporaram o vetor com o gene DHFR sobrevivam num meio sem hipoxantina e timidina [76, 77]. A amplificação do produto também pode ser conseguida através da adição de metotrexato ao meio, o qual inibe a atividade da DHFR, de modo que as células iniciam a amplificação do gene DHFR para garantirem a sua sobrevivência, resultando numa amplificação simultânea dos genes do anticorpo monoclonal [78]. Um outro exemplo é o do marcador de seleção glutamina sintetase (GS) que catalisa a formação de glutamina a partir de glutamato e amónia, e que é utilizado nas células NS0 deficientes na expressão deste gene, permitindo que as células transfetadas sobrevivam num meio sem glutamina [79, 80]. Uma vez mais, a amplificação pode ser conseguida através da adição de metionina sulfoximina, um inibidor da GS, cuja ação é semelhante ao metotrexato com a DHFR, forçando as células a amplificar o vetor que inclui o gene do anticorpo monoclonal [80]. Estando concluída a seleção e amplificação das células transfetadas, são escolhidos clones únicos para caracterização da qualidade do produto,
aplicação a uma escala industrial e avaliação da expressão a longo termo. É importante referir que a integração e a amplificação aleatória origina produtos bastante heterogéneos, fazendo com que o processo de produção e seleção de clones seja demorado e bastante trabalhoso [76]. Nesse sentido, têm surgido desenvolvimentos recentes para a seleção de clones com elevada eficiência de produção utilizando automação, de maneira a reduzir o tempo dispensado e melhorar a consistência do processo. A citometria de fluxo aplicada à separação de células ativada por fluorescência permite uma rápida monitorização de milhões de células para isolar subpopulações específicas de vários produtos extremamente heterógenos, e pode ser aplicada à separação de células produtoras de anticorpos marcados à superfície, uma vez que os níveis de proteínas excretadas são proporcionais aos níveis de proteínas encontradas à superfície da célula [81].