A RDC 166 da ANVISA foi recentemente publicada, flexibilizando alguns aspectos, trazendo alguns requisitos não constantes na resolução anterior (RDC 899 de 2003) e deixando mais claro os procedimentos de preparo de amostras. Dentre as flexibilizações estão a possibilidade do uso de substâncias químicas caracterizadas como referências, desde que devidamente comprovado seu grau de pureza, e a avaliação dos critérios de aceitação, como para a exatidão e precisão. O parâmetro da linearidade agora é analisado de forma mais crítica e foi integralizada a avaliação do efeito matriz para amostras complexas (ANVISA, 2003; ANVISA, 2017).
5.2.4.1 Seletividade
A seletividade é entendida como a capacidade do método de detectar o analito frente a outros interferentes. Na RDC 166, para avaliação dos possíveis interferentes em métodos quantitativos, é exigida a demonstração da seletividade do método em condições de degradação forçada das amostras em diferentes condições, porém não há a especificação dessas condições. A RDC 53 de 2015 da ANVISA regulamenta as condições de degradação forçada para medicamentos, citando as condições sem especificá-las, mas estabelece quais são a extensão de degradação, que deve ser superior a 10% (ANVISA, 2017; ANVISA, 2015). As condições de exposição forçada presentes em ambas as RDCs são: ácida, básica, oxidativa, temperatura e luz.
Os cromatogramas de todas as condições de degradação forçada na CLAE e CLUE estão apresentados nas figuras 41 e 42. O teor de AFE e NIC em cada condição por CLAE e CLUE estão demonstrados na tabela 14.
Figura 16 ‒ Cromatogramas por CLAE da seletividade: AFE (A); NIC (B); 24h (C); Ácido (D); Básico (E); Oxidativo (F); Luz (G); Calor (H); AFE, NIC e produtos da degradação básica e fotolítica (I).
Fonte: autoria própria
Para o método por CLAE não houve coeluição de AFE e NIC com os produtos de degradação. A resolução entre NIC (TR 3,59 min) e seu produto básico (TR 3,29 min), foi de 1,51. A resolução entre o AFE (TR 12,95 min) e seu produto da luz (TR 11,93 min) foi de de 3,43.
Figura 17 ‒ Cromatogramas por CLUE da seletividade: AFE (A); NIC (B); 24h (C); Ácido (D); Básico (E); Oxidativo (F); Luz (G); Calor (H); AFE, NIC e produtos da degradação básica e fotolítica (I).
Fonte: autoria própria
Para o método por CLUE também não houve coeluição de AFE e NIC com os produtos de degradação. A resolução entre NIC (TR 1,75 min) e seu produto básico (TR 1,53 min), foi de 1,71. A resolução entre o AFE (TR 4,65 min) e seu produto da luz (TR 3,54 min) foi de 5,51.
Tabela 10 ‒ Teor de AFE e NIC na seletividade para CLAE e CLUE. CLAE
Condição Teor de AFE (% ± DP) Teor de NIC (% ± DP)
Ácido 101,52 ± 0,95 101,35 ± 1,01 Básico 100,36 ± 1,14 66,33 ± 0,69 Oxidativo 101,28 ± 0,48 100,58 ± 0,27 Luz 80,32 ± 1,49 100,69 ± 1,64 Calor 107,58 ± 6,32 107,36 ± 6,09 Controle 100,1 ± 0,69 100,3 ± 1,35 CLUE
Condição Teor de AFE (% ± DP) Teor de NIC (% ± DP)
Ácido 97,42 ± 2,83 100,02 ± 1,43 Básico 99,28 ± 1,33 68,16 ± 1,31 Oxidativo 97,06 ± 2,36 101,72 ± 0,33 Luz 71,97 ± 6,07 98,57 ± 1,40 Calor 98,52 ± 2,78 99,90 ± 0,86 Controle 100,01 ± 1,91 98,07 ± 1,46 DP: desvio padrão Fonte: autoria própria
As condições de degradação utilizadas nesse estudo são condições bem estabelecidas na literatura, por exemplo, como os estudos de degradação forçada realizados por Kaur et al. (2016) e Jadhav et al. (2015). Ainda, nessas condições de estresse foi obtida degradação superior a 10%, como estabelecido na RDC 53 de 2015 (ANVISA, 2015).
A degradação da NIC e do AFE ocorreu no meio básico e na presença de luz, respectivamente, com degradação próximo a 30% da NIC e a 20% do AFE. O provável produto de degradação básica da NIC é o ácido nicotínico, ou ácido piridino-3- carboxílico (figura 43), como observado por Thomas et al. (2012). Para verificar se nesse estudo ocorreu o mesmo comportamento de degradação da NIC foi realizada uma análise com o ácido nicotínico; em que foi possível perceber a eluição do ácido nicotínico (figura 44) no mesmo tempo de retenção, 1. do produto básico (figura 42E), bem como espectros com alta similaridade (figura 45).
Figura 18 ‒ Estruturas químicas do ácido nicotínico e vanilina.
Fonte: autoria própria
Figura 19 ‒ Cromatograma do ácido nicotínico por CLUE.
Fonte: autoria própria
Figura 20 ‒ Espectros UV do produto da degradação básica da NIC (A) e do ácido nicotínico (B) obtidos por CLUE DAD.
Fonte: autoria própria
De acordo com Flores et al. (2016) e Di Paola et al. (2015) a vanilina, ou 4- hidroxi-3-metilbenzaldeido (figura 43), é um produto de degradação do AFE na presença da luz e de outros catalisadores como o óxido de titânio; no entanto no
presente estudo a valinina não foi o produto de degradação da luz do AFE. Nitidamente, no cromatograma da vanilina (figura 46), o pico da amostra não corraborou com o produto de degradação da luz (figura 42G). A vanilina apresentou TR de 5,55 min, enquanto o produto da luz apresentou TR de 3,54 min, ainda os espectros UV apresentaram baixa similaridade (figura 47). Assim pode-se pensar na hipótese de que o produto da luz do AFE é seu isômero cis, pois na literatura já é abordada a formação do isômero cis e claramente foi observada essa isomerização por Horbury et al. (2016), ao induzirem a isomerização do AFE na presença de luz UV.
Figura 21 ‒ Cromotograma da vanilina por CLUE.
Fonte: autoria própria
Figura 22 ‒ Espectros UV do produto da degradação fotolítica do AFE (A) e da vanilina (B) obtidos por CLUE DAD.
Estudos presentes na literatura demonstram a validação de métodos analíticos para quantificação do ácido AFE por CLAE, porém esses indicam a degradação do AFE em meio básico e ácido sem dissertar acerca dos possíveis produtos de degradação na mesma condição de preparo (NaOH e HCl 0,1 M a temperatura ambiente) e amostras com concentração próximas (NADAL, 2016) e outros não demonstram a degradação do AFE na presença da luz (LIMA; KHALIL; MAINARDES, 2017), esse último não especificou as condições de exposição a luz, pode não ter acontecido radiação suficiente, pois já se sabe que o AFE é fotossensível em solução (ANSELMI et al., 2008; HORBURY et al., 2016). Assim, esses resultados divergem do presente estudo.
5.2.4.2 Linearidade
A linearidade é a capacidade do método de obter respostas diretamente proporcionais às concentrações do analito. A representação gráfica das respostas em função da concentração do analito, equações das retas e os valores R e R² estão mostrados na figura 48. Em ambos os casos os R e R² apresentaram valores maiores 0,99, como determina a resolução. Assim nesse requisito há uma associação linear da área com o aumento da concentração de AFE e NIC, tanto por CLAE quanto por CLUE.
Figura 23 ‒ Representação gráfica da resposta em função da concentração, equações das retas e valores de R e R² do AFE (A) e NIC (B) obtida por CLAE e do AFE (C) e NIC (D) por CLUE.
Fonte: autoria própria
O gráfico de dispersão dos resíduos dos padrões de para ambas as metodologias estão mostrados na figura 49.
Figura 24 ‒ Gráfico de dispersão dos resíduos para o AFE (A) e NIC (B) obtida por CLAE e do AFE (C) e NIC (D) por CLUE.
Fonte: autoria própria
Os resíduos são as diferenças dos valores de área previstos (a partir da regressão) e os dados reais; quando padronizados a partir das médias e desvios padrão é possível avaliar a normalidade de suas distribuições. A distribuição normal ocorre quando os resíduos se apresentam de forma aleatória entre a faixa padronizada e nenhum é encontrado entre +3 e -3; isso indica que a reta está ajustada ao modelo. Já a homocedasticidade implica em descrever que os desvios padrão de Y (área) são iguais independentemente do valor de X (concentração), garantindo que a reta de regressão é adequada para toda a faixa estipulada (RUMSEY, 2013). Além da inspeção visual, a verificação da distribuição normal e homocedasticidade é dada com auxílio de testes estatísticos, como mostra a tabela 15.
Tabela 11 ‒ Testes estatísticos para avaliação da linearidade. CLUE
Estudo AFE NIC
Valor p Valor p
Normalidade dos resíduos 0,4806 0,3639 0,4549 0,2307
Homocedasticidade 0,3787 0,3597 0,491 0,3357
Coeficiente angular 35472 0 21574 0
CLAE
Estudo AFE NIC
Valor p Valor p
Normalidade dos resíduos 0,2788 0,5957 0,5296 0,1466
Homocedasticidade 0,6441 0,0802 0,456 0,4378
Coeficiente angular 3357 0 4,7784 0
Fonte: autoria própria
Como o valor de p do teste de Anderson-Darling é maior que 0,05, há uma distribuição normal dos resíduos ao nível de significância de 5%, para AFE e NIC. Como o valor de p do teste de Cochran é maior que 0,05, o modelo homocedástico não é descartado ao nível de significância de 5%, para AFE e NIC. Como o valor de p é menor que 0,05 no teste F da ANOVA, o coeficiente angular é diferente de 0 ao nível de significância de 5%, para o AFE e NIC tanto por CLAE quanto por CLUE.
5.2.4.3 Precisão
A precisão indica a capacidade do método de promover respostas proximas de uma mesma amostra, se o método é reprodutível. A avaliação da precisão é realizada de três formas pela RDC 166: repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade. A repetibilidade é realizada preparando as amostras de forma independente (sem diluições de uma mesma solução mãe), o que também vale para a precisão intermediária que é realizada no mesmo laboratório por analistas diferentes, em pelo menos dois dias. Já a reprodutibilidade indica a proximidade de dos resultados obtidos em diferentes laboratorios. A repetibilidade e precisão intermediária são obrigatórias para métodos de doseamento e em ambos os casos são interpretadas pelo DPR. Os valores de DPR para a repetibilidade e precisão
intermediária, para AFE e NIC por CLAE e CLUE, estão mostrados na tabela 16, em ambos os casos o valor de DPR está próximo de 2%, indicando uma boa precisão.
Tabela 12 ‒ Valores de repetibilidade e precisão intermediária para o AFE e NIC por CLAE e CLUE.
CLAE CLUE
DPR (%)
AFE NIC AFE NIC
Repetibilidade Dia 1 2,20 2,16 1,51 2,23
Dia 2 2,46 1,47 2,43 2,52
Precisão intermediária
2,33 1,81 1,97 2,37
DPR: desvio padrão relativo Fonte: autoria própria
5.2.4.4 Exatidão
A exatidão representa a concordância entre um valor experimental e um valor aceito como verdadeiro, interpretada em termos de DPR e recuperação, como demonstra a equação 6. Os valores de DPR e recuperação para cada nível de AFE e NIC por CLAE e CLUE estão mostrados na tabela 17. Em todos os níveis a exatidão foi próximo de 100%, indicando proximidade do valor encontrado (amostras) com o valor real (padrões), com baixos valores de DPR.
Tabela 13 ‒ Valores de recuperação para o AFE e NIC por CLAE e CLUE. CLAE
AFE NIC
Nível Rec. / DPR (%) Nível Rec. / DPR (%)
Baixo (5 µg/mL) 99,11 / 0,18 Baixo (3,1 µg/mL) 99,20 / 0,99 Médio (25 µg/mL) 100,10 / 1,17 Médio (15,7 µg/mL) 101,06 / 1,28 Alto (45 µg/mL) 100,29 / 1,06 Alto (28,2 µg/mL) 100,63 / 1,82
CLUE
AFE NIC
Nível Rec. / DPR (%) Nível Rec. / DPR (%)
Baixo (8 µg/mL) 101,43 / 0,73 Baixo (5 µg/mL) 102,81 / 0,55 Médio (15µg/mL) 101,46 / 1,91 Médio (7,5 µg/mL) 100,45 / 1,49 Alto (22 µg/mL) 99,99 / 0,83 Alto (13,8 µg/mL) 100,68 / 0,67
Rec.: recuperação média em%; DPR: desvio padrão relativo Fonte: autoria própria
5.2.4.5 Robustez
A capacidade do método analítico em resistir a pequena e deliberadas variações nas condições analíticas está no conceito de robustez. A RDC 166 estipula que para métodos quantitativos os resultados da robustez devem ser avaliados com os mesmos critérios da exatidão (DPR e recuperação). Os valores de DPR e recuperação para o AFE e a NIC por CLAE e CLUE são visualizados na tabela 18. Em todos os parâmetros a recuperação foi próximo de 100% com baixo DPR, indicando que pequenas variações são suportadas pelos métodos.
Tabela 14 ‒ Valores de recuperação para os parâmetros de robustez do AFE e NIC por CLAE e CLUE. CLAE
Parâmetro Variações AFE NIC
Rec. / DPR (%) Rec. / DPR (%) pH 4,7 100,72 / 1,51 99,97 / 0,97 4,5 102,50 / 1,63 99,57 / 0,66 Metanol (%) 32 101,57 / 0,69 97,77 / 0,74 28 101,50 / 1,03 99,51 / 0,78 Temperatura (ºC) 38 100,39 / 1,23 98,11 / 0,94 42 102,42 / 1,90 100,88 / 0,41 Fluxo da fase móvel (mL/min) 0,9 101,27 / 1,67 98,68 / 0,79 1,1 98,39 / 1,40 99,36 / 0,97 CLUE
Parâmetro Variações AFE NIC
Rec. / DPR (%) Rec. / DPR (%) pH 4,5 101,93 / 1,60 102,71 / 2,58 4,7 101,74 / 1,22 99,72 / 2,00 Metanol (%) 24 102,87 / 1,42 103,84 / 2,49 26 102,96 / 1,34 103,20 / 2,37 Temperatura (ºC) 39 100,64 / 1,43 103,21 / 2,43 41 103,07 / 1,50 100,40 / 2,54 Fluxo da fase móvel (mL/min) 0,39 102,20 / 1,72 103,15 / 2,56 0,41 100,54 / 1,66 102,28 / 2,54
Rec.: recuperação média em%; DPR: desvio padrão relativo Fonte: autoria própria
5.2.4.6 Limites de detecção e quantificação
Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) representam a menor concentração que os analitos podem ser detectados e quantificados com confiabilidade, respectivamente. Os LD e LQ para o AFE e a NIC por CLAE e CLUE estão mostrados na tabela 19. Embora a CLUE apresentou uma faixa de linearidade mais curta comparada a CLAE, a CLUE apresentou menor LD e LQ que a CLAE para ambas as moléculas.
Tabela 15 ‒ LOD e LOQ para AFE e NIC por CLAE e CLUE. CLAE AFE NIC LD 1,75 µg/mL 1,17 µg/mL LQ 5,85 µg/mL 3,93 µg/mL CLUE AFE NIC LD 0,96 µg/mL 0,74 µg/mL LQ 3,21 µg/mL 2,49 µg/mL
Fonte: autoria própria
Dessa forma todos os parâmetros necessários para a validação de um método analítico quantitativo foram obedecidos.
Tanto o AFE quanto a NIC são moléculas utilizadas em cosméticos já cormercializadas devido à capacidade de proteção UV e no tratamento de hipercromias, respectivamente (TEE-NGAM et al., 2013; FORBAT; AL-NIAIMI; ALI, 2017). Nesse contexto, as metodologias desenvolvidas também podem ser aproveitadas, e se necessário adaptá-las, por exemplo com um preparo de amostra para não interferência de excipientes, para o doseamento dessas substâncias em formulações cosméticas.
CAPÍTULO III
Planejamento experimental para o cocristal de ácido ferúlico e
nicotinamida
6 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL PARA O COCRISTAL DE ÁCIDO FERÚLICO