Les expériences réalisées sur des myotubes exprimant l’AnxA1-GFP montrent deux types de résultats. Le cas le plus observé est celui représenté par le myotube 1 (Figure 3.1a). Après le dommage, l’AnxA1-GFP est immédiatement recrutée au site de rupture (+1,3 s). Au cours du temps, nous avons observé que l’AnxA1-GFP s’accumule progressivement au niveau de la membrane endommagée, sans modification de la fluorescence intracellulaire globale du myotube. Cela peut indiquer que l’influx de calcium est très localisé, entrainant uniquement le recrutement d’AnxA1-GFP proche du site de rupture. De plus, l’AnxA1-GFP accumulée forme une structure bien délimitée et localisée à la zone endommagée. Pendant la réparation membranaire des fibres musculaires de souris, il a été montré que l’AnxA1 se concentre dans
Résultats
77 une structure que les auteurs ont appelée domaine « cap » (Demonbreun et al., 2016b). Dans cette étude de Demonbreun et collaborateurs, ce domaine forme clairement une protubérance, et une zone sans AnxA1 est retrouvée sous le domaine « cap ». En regardant de plus près la zone de rupture du myotube 1 à différents plans, on constate que le cluster d’AnxA1-GFP est effectivement positionné au-delà de la position initiale du sarcolemme, et forme une structure très dense qui laisse penser à du matériel membranaire (Figure 3.1b).
Figure 3.1 : Expériences de rupture membranaire sur les myotubes exprimant l’AnxA1-GFP.
Les myotubes LHCN-M2 ont été transfectés avec le plasmide pA1-GFP, et des expériences de rupture membranaire ont été réalisées 2 jours après la dernière transfection. Flèche blanche, zone avant l’irradiation ; flèche rouge, zone après l’irradiation. (a) Barre d’échelle : 10 µm. (b) Zoom du site de rupture des myotubes 1 et 2 avant et plus de 65 s après l’irradiation. Les 3 images à plus de 65 s correspondent à 3 plans différents. Ligne blanche, membrane plasmique avant l’irradiation ; ligne rouge, membrane plasmique après l’irradiation. Barre d’échelle : 5 µm.
Par la suite, nous appellerons domaine « cap » toute protubérance membranaire située au site de rupture. De plus, sur l’image de droite de la Figure 3.1b, on constate une zone dépourvue d’AnxA1-GFP sous le domaine « cap ». Un résultat similaire a été observé dans les fibres musculaires de souris, où il a été montré que cette zone était constituée d’actine (Demonbreun et
Résultats
78
al., 2016b). Bien que la présence d’actine ne soit pas à exclure dans notre cas, cette zone donne l’impression que le domaine « cap » est sur le point de se détacher de la cellule. L’utilisation de phalloïdine couplée à un fluorophore pour visualiser les filaments d’actine permettrait de répondre à cette question. Par manque de temps, nous n’avons pas encore réalisé cette expérience. Le deuxième cas de figure observé, dû à la variabilité expérimentale, se produit lorsque le dommage est plus important, avec une rupture de la membrane large d’au moins 2 µm immédiatement après l’irradiation. Comme dans le myotube 1, l’AnxA1-GFP est immédiatement recrutée au site de rupture (Figure 3.1a, +1,3 s). En revanche, la déchirure semble s’étendre au cours du temps, tandis que de nombreux spots fluorescents apparaissent dans le cytoplasme (+13,0 s), en progressant vers le site de rupture (+26,0 s), comme observé dans les cellules endothéliales humaines (Koerdt and Gerke, 2017). De plus, la fluorescence globale de la cellule semble diminuer lorsque l’AnxA1-GFP se concentre à la zone endommagée. L’étendue du dommage implique une augmentation importante de la concentration calcique intracellulaire, ce qui peut expliquer un recrutement conséquent d’AnxA1-GFP au niveau de la zone endommagée. L’observation des spots fluorescents qui se concentrent au site de rupture pourrait correspondre au recrutement de vésicules intracellulaires tapissées d’AnxA1-GFP. L’AnxA1-GFP pourrait donc être associée aux vésicules intracellulaires pour la formation d’un « patch » qui colmate la rupture, comme proposé dans les fibres musculaires de souris (Lennon et al., 2003). La diminution de la fluorescence associée à l’AnxA1-GFP dans la cellule après 60 s peut indiquer la réparation de la membrane, le retour à l’homéostasie calcique, et la libération de l’AnxA1-GFP interagissant avec les membranes. Pour rappel, un myotube LHCN-M2 se répare en moyenne en 80-90 s (voir Figure 2.11). Seul un cluster d’AnxA1-GFP reste présent au-delà d’une minute. Les images zoomées du site de rupture montrent une rétractation de la membrane après le dommage (ligne rouge vs ligne blanche) qui peut s’expliquer par la déchirure de la membrane. Une zone concentrée en AnxA1-GFP est bien observé à l’extérieur du myotube. Elle pourrait correspondre au domaine « cap » décrit par Demonbreun et collaborateurs. En revanche, aucune zone dépourvue d’AnxA1-GFP n’est observée sous le domaine « cap ».
Dans les deux cas de figures, l’AnxA1-GFP est immédiatement recrutée au site de rupture après le dommage membranaire, et se concentre pour finalement former un domaine « cap » situé à l’extérieur du myotube endommagé. L’apparition de spots fluorescents pouvant correspondre à des vésicules intracellulaires associées à l’AnxA1-GFP n’a été observée que lors d’un dommage important induisant une déchirure de la membrane plasmique. Lors d’un dommage plus faible,
Résultats
79 l’AnxA1 pourrait être associée uniquement à la membrane plasmique et/ou aux vésicules les plus proches du site de rupture, ce qui suffirait à colmater la déchirure. La résolution du microscope pourrait nous empêcher de visualiser ces quelques vésicules.
Nous avons ensuite voulu savoir si l’AnxA1 endogène est elle aussi retrouvée dans un domaine « cap ». Pour cela, nous avons irradié des myotubes non modifiés et immunomarqué l’AnxA1 pour la visualiser en microscopie de fluorescence. Il faut noter que les cellules sont fixées plusieurs minutes (au moins 10 min) après l’irradiation, ce qui signifie que les images de fluorescence représentent la localisation des Anx bien après la réparation de la membrane. La
Figure 3.2 montre un petit domaine « cap » enrichi en AnxA1 au niveau de la zone irradiée. Cette observation indique que le « cap » se forme dans les myotubes non modifiés, que l’AnxA1 endogène se concentre également dans ce domaine et que cette structure persiste plusieurs minutes après le dommage et la réparation de la membrane.
Figure 3.2 : Distribution de l’AnxA1 endogène dans les myotubes LHCN-M2 endommagés. La membrane plasmique des myotubes LHCN-M2 a été endommagée par irradiation laser. Les myotubes ont été immunomarqués pour l’AnxA1 et observés en microscopie de transmission et de fluorescence. Flèche rouge, zone irradiée. Barre d’échelle : 5 µm.