97 J2. kDa>
ôçkoap-46 kDa> 30 anticorps
purifié
123456 7 8 9
10Fig. 16: Immunodétection de la protéine P0071 de chien à l’aide de l’anticorps synthétisé chez le lapin.
Les parties gauche et droite du gel représentent respectivement les tests réalisés avec l’anticorps non purifié et purifié.
Les pistes 1 à 5 et 6 à 10 sont immunodétectées respectivement à l’aide de l’anticorps préimmun et immun (purifiés ou non).
Les pistes 1 et 6 contiennent un extrait protéique de bactéries, transformées par le vecteur pMal-cRI® recombinant, contenues dans 200 pl de culture induite 5 heures à 0.1 mM d’IPTG, 30° C.
Les pistes 2, 7 et 3, 8 contiennent 100 pg d’un extrait protéique de cellules COS transfectées respectivement par le vecteur pCDNA3 HisC® sauvage et recombinant (permettant l’expression de la protéine p0071).
Les pistes 4, 9 et 5, 10 contiennent respectivement 80 pg d’un extrait protéique de cellules thyroïdiennes de chien en culture primaire stimulées 24 heures à la forskoline et 100 pg d’un extrait protéique de tissu thyroïdien de chien.
La protéine C3VS Résultats et discussion
présent uniquement dans l’extrait protéique des bactéries transformées par la construction permettant l’expression de la protéine de fusion impliquant la P0071 et dans le culot de sonication de ces mêmes bactéries (pistes 4 et 6).
Comme précédemment, un profil de dégradation de la protéine de fusion, peu visible en coloration au bleu de Coomasie, a été mis en évidence par l’expérience d’immunodétection.
La relative pmeté de la protéine de fusion après sonication nous a permis, comme nous le verrons brièvement dans le chapitre suivant, de tenter une synthèse d’anticorps. Ceci a été réalisé en injectant la protéine de fusion purifiée directement sur gel de polyacrylamide.
3.9 Synthèse d’anticorps
Afin d’augmenter les chances d’obtenir rapidement un anticorps polyclonal dirigé contre la protéine P0071 de chien, plusieurs stratégies d’immunisation ont été réalisées en parallèle.
Deux premières stratégies, basées l’une sur l’injection d’un peptide correspondant à la région C-terminale de la protéine (STKRPSYRAEQYPGS) couplé à l’hemocyanine, l’autre sxir l’injection d’acrylamide broyé contenant la protéine P0071 produite à partir du système pET28A®, n’ont pas permis d’obtenir im sérum contenant des anticorps dirigés contre la protéine.
Une troisième stratégie, basée siu l’injection de la protéine de fusion MBP-P0071 en solution, a permis d’obtenir un sérum polyclonal présentant les caractéristiques attendues (fig. 16). Le sérum brut obtenu ainsi que les anticorps purifiés ont été testés sur plusieurs types d’extraits protéiques dont : un extrait protéique total de bactéries surexprimant la protéine de fusion MBP-P0071 (pistel et 6) (voir paragraphe 3.8.1), vm extrait de cellules COS transfectées par la construction pCDNASHisC permettant l’expression de la protéine de fusion His-P0071 (piste 3 et 8), ainsi qu’un extrait protéique de tissu thyroïdien de chien et de cellules thyroïdiennes en culture primaire (pistes 5, 4 et 10,9).
Les résultats montrent:
- Dans le cas du sérum préimmim: absence de signaux significatifs.
-
Dans le cas du sérum immun non purifié: présence d’un signal très important dans la piste correspondant à l’extrait protéique bactérien (piste 6), compatible avec l’image de dégradation protéique observée en immunodétection dans ce type d’extrait (voir paragraphe 3.8.2). Apparition d’un signal spécifique au poids moléculaire attendu, (environ 130 kDa) dans l’extrait protéique de cellules COS transfectées par la construction permettant l’expression de la protéine de fusion His-P0071 (pistes 8). Présence de deux bandes proches à un poids moléculaire légèrement inférieur à 69 kDa dans les extraits protéiques de cellules et tissu thyroïdien.- Dans le cas du sérum immun purifié: diminution du bruit de fond général, mais également de l’intensité des signaux observés. Les principaux signaux décrits ci-avant sont également présents dans cette expérience, et le doublet observé dans les extraits protéiques de cellules et tissu thyroïdien, est également visible mais seulement à des temps d’exposition plus longs que celui utilisé pour obtenir le résultat montré à la figure 16.
La discordance de taille et la faiblesse du signal détecté dans les extraits thyroïdiens rendent délicate l’interprétation du résultat obtenu. L’observation de bandes de tailles inférieures à la taille attendue suggère l’existence d’un phénomène de protéolyse, qui pourrait survenir lors de la préparation ou de la manipulation de l’extrait protéique.
Les résultats obtenus montrent que ce sérum contient bien des anticorps dirigés contre la P0071 de chien, puisqu’il est notamment capable de détecter cette protéine dans des extraits protéiques de cellules COS la surexprimant.
3.10 Localisation subcellulaire de la P0071 de chien
Rappelons que la séquence partielle P0071 mise en évidence lors du criblage "double- hybride" résultait vraisemblablement d’un phénomène d’amorçage interne lors de la synthèse des ADNc de la banque. Cet amorçage interne aurait eu lieu dans la région codant le sixième motif "armadillo" au niveau d’une séquence riche en nucléotide adénine codant huit lysines. Il est intéressant de noter que les régions riches en acides aminés basiques sont connues pour jouer parfois le rôle de "séquence de localisation nucléaire" (NLS) (Nigg 1997).
Fig. 17: Localisation subcellulaire de la protéine de fusion GFP-p0071 de chien.
La partie gauche de la figure représente une cellule COS transfectée exprimant la protéine de fusion EGFP-p0071 de chien. La partie droite de la figure représente quant à elle plusieurs cellules COS transfectées exprimant la protéine de fusion EGFP-homéodomaine TTF1.
Afin de démontrer une éventuelle localisation nucléaire de la P0071 de chien, nous avons produit celle-ci sous la forme d’une protéine fusionnée à la séquence EGFP ("enhanced green fluorescent protein") (Tsien R.Y. 1998) afin de localiser par microscopie à fluorescence la protéine de fusion produite in vivo, après transfection de cellules COS (fig. 17).
Le résultat obtenu montre que la protéine de fusion générée présente une localisation aussi bien cytoplasmique que nucléaire, alors que le contrôle positif, constitué de la protéine de fusion EGFP-homéodomaine de TTFl, montre une localisation nucléaire franche.
Il serait prématuré d’en tirer comme conclusion que la protéine P0071 de chien ne présente à aucun moment une localisation nucléaire, mais nous ne disposons pas d’informations sur les modulations éventuelles subies par la protéine lors de diverses stimulations de la cellule qui pourraient modifier sa répartition dans la cellule.
C’est, par exemple, le cas de la protéine p-catenine qui fait partie de la famille des protéines à motif "armadillo" et qui présente une localisation membranaire, cytoplasmique et nucléaire selon les régulations auxquelles elle est soumise (Orsulic et al. 1999).
3.11 Production et purification d’une protéine de fusion GST-
C3VS
Afin de confirmer par méthode biochimique l’interaction mise en évidence en "double- hybride", nous avons décidé d’utiliser la méthode du "GST-puUdown assay" qui consistait à faire interagir les deux partenaires, produit in vitro ou in vivo, par deux voies différentes: une des deux protéines est produite en bactérie sous forme de fiision avec la protéine Glutathion-S-transferase (GST), tandis que le partenaire est produit, soit en système de transcription-traduction in vitro, soit par surexpression en cellules COS transfectées.
Le couple potentiel, dont la propriété est de former un complexe, est isolé par la fixation de la GST à une résine glutathion-sépharose. Cette méthode est fréquemment utilisée pour confirmer des résultats "double-hybride" de par sa relative facilité d’utilisation.
La protéine C3VS a été choisie potir être produite sous forme de fiision avec la GST pour deux raisons: premièrement parce que d’autres partenaires de cette protéine étant à
2.20 feoa ► GST-<9VS^
Ç7^koa
6ç koa
►4ÉkDa
► jo^Dh ► I 2 4 5 6 7Fig. 18: Production de la protéine de fusion GST-C3VS.
Gel de protéine SDS-PAGE 10 % contenant le marqueur de poids moléculaire (piste 1) ainsi que les extraits protéiques de bactmes, transformées par le vecteur pGEX-4T2® recombinant, contenues dans 200 pl de culture avant et après 1, 2,3,4 et 5 heures d’inducticm à l’IPTG 0.1 mM, 30° C (pistes 2 à 7).
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-<fi«i(mGST-C3VS
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►6çkDa
► lu4ôkDa
►Fig. 19: Fixation et immunodétection de la protéine de fusion GST-C3VS sur billes de glutathion-sépharose. La partie gauche de la figure représente une coloration au bleu de Coomasie d’un gel SDS-PAGE 10 % contenant le marqueur de poids moléculaire (piste 1) et les culots de billes de glutathion sépharose isolées après mise en présence d’extraits de bactéries transformées par le vecteur pGEX-4T2® sauvage permettant l’expression de la protéine GST seule (piste 2) et le vecteur recombinant permettant l’expression de la protéine de fusion GST-C3VS (piste 3).
Ces extraits sont obtenus au départ de 20 ml de culture bactérienne induite 4 heures à 0.1 mM d’IPTG, 30° C.
La partie droite de la figure représente l'immunodétection de l’équivalent de la piste 3 à l’aide de l’anticorps anti-GST de lapin à la dilutiœi 1/200.
l’étude, elle aurait pu être utilisée pour confirmer ces interactions, et deuxièmement parce que des deux partenaires, elle représentait le plus petit poids moléculaire, ce qui pouvait s’avérer un avantage dans la mise au point de la production de la protéine de fusion.
La séquence codant la protéine C3VS a donc été clonée dans le vecteur pGEX4T-2 (Pharmacia Biotech cat. 27-4581) permettant l’expression de la protéine hybride.
Les conditions idéales d’expression ont été déterminées à 4 heures d'induction, 30° C, 0.1 mMd’IPTG.
Les résultats présentés à la figure 18 montrent l’apparition progressive au cours du temps d’une bande au poids moléculaire attendu d’environ 130 kDa (104+27 kDa) dans les extraits protéiques de bactéries exprimant la protéine de fusion GST-C3VS. Cette bande était absente de l’extrait protéique de bactéries avant stimulation à l’IPTG.
Des expériences de fixation de la protéine de fusion à la résine glutathion-sépharose ont alors été réalisées; les résultats présentés à la figure 19 montrent, après coloration du gel SDS-PAGE au bleu de Coomasie, une fixation importante de la protéine GST seule (piste 2), démontrée par un signal de très grande intensité aux environs de 27 kDa. Par contre, la fixation de la protéine de fusion GST-C3VS montre un profil plus altéré (piste 3), où l’on retrouve la bande au poids moléculaire attendu, accompagnée de signaux de plus petite taille. Un transfert du contenu de cette piste sur membrane de nitrocellulose, suivi d’une immunodétection réalisée à l’aide de l’anticorps anti-GST (Santa Cruz cat. 459), a permis de montrer que toutes ces bandes correspondaient à des produits de dégradation de la protéine de fusion.
Ce problème de dégradation résultait très probablement de la grande taille des protéines manipulées, ce qui est un paramètre que l’on ne peut modifier au risque de perdre les motifs importants pour l’interaction.