Chez l’adulte, et dans les conditions physiologiques normales, les astrocytes sont des cellules immobiles, de forme étoilée sans orientation privilégiée. L’apparition d’un site d’inflammation, à la suite d’une maladie ou d’une lésion du système nerveux, entraîne une réaction appelée gliose réactive. La libération de facteurs inflammatoires provoque notamment une réorientation des astrocytes qui migrent alors en direction du site lésé jusqu’à former une cicatrice gliale293,294. Nous avons donc testé l’effet d’une absence de
miR-146a sur les propriétés de migration des astrocytes. Pour ce faire, nous avons utilisé le
système Incucyte, un système de vidéomicroscopie pour les cellules en culture. Une fois les astrocytes à confluence, nous les avons traité avec un agent anti-mitotique, la cytosine- β-D arabinofuranoside (ARAC), afin que le défaut de prolifération ne perturbe pas l'interprétation des résultats. Puis nous avons réalisé une blessure au centre de chaque puits et enregistré la progression des astrocytes et la fermeture de la blessure grâce à des photos prises toutes les heures pendant 48h. Aucune différence dans la capacité de migration n'a été observée entre les astrocytes Mir146a-/- et les wild type (WT)(Fig.23A,B). Nous avons ensuite voulu tester si les astrocytes Mir146a-/- arboraient les mêmes défauts de prolifération et de capture de glutamate que ceux sur-exprimant le miARN. Trois expériences indépendantes ont été réalisées comme précédemment sur le système Xcelligence, ce qui nous a permis de montrer un défaut persistant de prolifération des astrocytes Mir146a-/- (Fig.23C,D).
En reproduisant les mêmes expériences que précédemment avec le glutamate tritié et le bloqueur ubiquitaire PDC, aucune différence n'a pu être observée dans la capture du glutamate entre astrocytes WT et Mir146a-/- (Fig.24A). Afin d'analyser plus finement le
transport du glutamate, nous avons répété ces expériences en utilisant soit un bloqueur spécifique de GLAST (UCPH101) soit un bloqueur spécifique de GLT-1 (WAY213613). Après avoir ajouté le WAY213613, GLAST était le seul transporteur encore actif et, comme avec le PDC, aucun défaut de recapture de glutamate n'a été observé (Fig.24B). Cependant, en bloquant uniquement GLAST, les astrocytes Mir146a-/- ont incorporé significativement plus de glutamate que les WT, suggérant une défaut de capture de glutamate spécifique de GLT-1 (Fig.24C,D).
GLT-1 étant une cible prédite de miR-146a, son expression pourrait être augmentée dans les astrocytes Mir146a-/-, ce qui expliquerait les résultats précédents. Nous avons donc cloné la région du 3'UTR de Slc1a2 contenant deux sites de fixation prédits de miR-146a (Fig.25A) dans le plasmide Psicheck2 exprimant la luciférase puis nous avons co-transfecté des cellules HEK293T avec ce plasmide et le miR-146a. Le plasmide Psicheck 2 exprime deux types de luciférase : la Renilla, fusionnée au 3'UTR de
Slc1a2 et la Firefly, indépendante du niveau d'expression de GLT-1 qui sert de facteur de
normalisation. Au cours de trois expériences indépendantes, nous avons observé une diminution du ratio Renilla/Fireflyen présence de miR-146a, confirmant que GLT-1 est bien une cible directe de miR-146a (Fig.25B). Le 3'UTR de Slc1a2 contient deux sites possibles de fixation pour miR-146a. Afin de déterminer si les deux sites étaient fonctionnels, nous les avons inactivé par mutagenèse dirigée avant de réitérer les tests de luciférase. Si la mutation du site de fixation prédit le plus distal ne semble pas changer les résultats obtenus avec le 3'UTR sauvage (Fig.25D), la mutation du site proximal (Fig.25C) et la double mutation des deux sites (Fig.25E) abrogent l’effet de miR-146a sur le niveau d’expression de la luciférase.
Figure 23: Défaut de prolifération mais pas de migration des astrocytes Mir146a-/-. (A,B) Mesure de la vitesse de migration des astrocytes. La courbe (A) représente la fermeture de la blessure au cours du temps et l'histogramme (B) montre la vitesse de migration des astrocytes en µm/h. (C,D) Mesure de la vitesse de prolifération des astrocytes. La courbe (C) représente la mesure de l'impédance pendant 6 jours d'une seule expérience représentative de toutes tandis que l'histogramme (D) montre la moyenne des pentes de trois expériences indépendantes.
Figure 24: Défaut de capture du glutamate GLT-1-dépendante. (A,B,C) Les histogrammes
représentent la mesure de la recapture de glutamate après normalisation par la quantité totale de protéines et les cpm après blocage de (A) des deux transporteurs de glutamate GLT-1 et GLAST par le PDC, (B) GLT-1 seulement avec le WAY213613 ou (C) GLAST uniquement avec le UCPH101. Ces valeurs ont ensuite été normalisées par les résultats obtenus avec les astrocytes WT.(D) Le boxplot représente le ratio Mir146a-/-/WT des valeurs obtenues en A,B et C afin de
comparer l'effet des différents bloqueurs.
Figure 25: GLT-1 est une cible directe de miR-146a. (A) Séquences de miR-146a et des deux
sites de fixation prédits du 3'UTR de Slc1a2. Le cadre rouge entoure la région seed du miARN ainsi que les sites de fixations de l'ARNm (B-E) Les histogrammes représentent le ratio Renilla/Firefly après normalisation par la valeur obtenue avec le vecteur vide dans les conditions suivantes : (B) 3'UTR de Slc1a2 sauvage, (C) premier site de fixation muté, (D) second site de fixation muté et (E) double mutation des sites de fixation. Les tests statistiques sont effectués entre la condition test (miR-146a) et la condition de sauvetage (miR-146a + inhibiteurs de miR-
C - Conclusion
La sur-expression de miR-146a induit une diminution de la prolifération de astrocytes ainsi qu'une augmentation de 50% de la capacité de capture du glutamate. De
façon similaire, nous avons observé une baisse de prolifération des astrocytes Mir146a-/-
et une altération de leurs capacités de capture du glutamate. Cependant, les mécanismes sous-jacents sont probablement différents. Dans le cas des astrocytes sur-exprimant miR-
146a, le défaut de capture de glutamate ne semble pas être dépendant d'un transporteur en
particulier tandis que dans les astrocytes Mir146a-/- il est spécifique de GLT-1.
En utilisant la luciférase comme gène rapporteur, nous avons montré pour la première fois que Slc1a2, codant GLT-1, est une cible directe de miR-146a. Les analyses par mutagénèse dirigée démontrent qu’un seul des deux sites de fixation prédit du miARN est fonctionnel. Les deux sites de fixation ayant la même séquence et montrant tous les deux une complémentarité parfaite avec la région seed de miR-146a (Fig.25A), ils devraient être ciblés par le miARN avec la même efficacité. Les deux sites étant distants d’environ 1 kilobase (kb) d'écart, nous proposons que la différence observée entre les deux sites soit due à la conformation de l'ARNm qui empêcheraitl ’appariement du miARN au site distal. Une étude publiée en 2014 suggère en effet que la séquence entourant le site de fixation de l'ARNm peut avoir un impact sur la capacité d'appariement du miARN326.
Le défaut de capture de glutamate supporte l'hypothèse du rôle de miR-146a dans la régulation de la transmission synaptique et soulève la question du rôle éventuel de ce miR dans la formation des synapses. Ces dernières années, la voie de signalisation du TGF-β a été caractérisée comme principal facteur responsable de la croissance dendritique et de la synaptogenèse astrocyte-dépendantes chez l'homme et la souris327,328. Or, les principaux acteurs de cette voie, les protéines TRAF6 et SMAD2-4, sont des cibles directes de miR-146a247,265,329,330, suggérant un possible rôle de miR-146a dans la
synaptogenèse. Pour confirmer cette hypothèse, il serait intéressant de réaliser des expériences ex-vivo de co-cultures d’astrocytes et de neurones WT ou Mir146a-/- et d'évaluer l’effet des différents génotypes sur la croissance dendritiques de neurones.
Il est également intéressant de noter que les propriétés migratoires des astrocytes mutants ne sont pas affectées. Cette observation suggère que l'absence de miR-146a n'altère ni leur mouvement en conditions physiologiques ni leur capacité à migrer vers les zones endommagées afin de déclencher la réparation du tissu.
Si mes travaux n’ont pas abordé le rôle de miR-146a sur les autres fonctions astrocytaires telles que le contrôle du flux sanguin ou de l’homéostasie des ions et du pH extracellulaire, la littérature fournit des éléments d’informations. Ainsi, miR-146a a été identifié comme inhibant la signalisation des facteurs de croissance vasculaires épithéliaux (VEGF) dans le carcinome hépatocellulaire331 et les cellules endothéliales de la rétine332 via son action sur la voie NFκB. Or, la régulation de l'ouverture de la BHE par les astrocytes est principalement médiée par la voie de signalisation (VEGF)292. La voie NFκB constitue également un des principaux effecteurs de la réponse inflammatoire astrocyte-dépendante et l’effet de miR-146a sur cette voie a été clairement établi325. L'absence de miR-146a pourrait donc altérer la capacité des astrocytes à assurer les échanges vasculaires et à maintenir l’intégrité tissulaire du SNC.
Prises ensemble, ces données suggèrent que si le rôle de miR-146a dans les astrocytes s’exerce principalement au niveau de leur action modulatrice de la neurotransmission, il est probable que l’absence de ce miARN conduise également à des défauts de la synaptogenèse, des échanges vasculaires ou de la réponse inflammatoire.