Au laboratoire, nous avons établi la lignée de souris de fond génétique C57BL6/J (Gardier et Bourdin 2001) originaires de Deltagen Inc, invalidées pour le gène Opn4 (homozygotes Opn4-/- et hétérozygotes Opn4+/-) à partir d'un couple de souris hétérozygotes Opn4+/- de fond génétique 129Sv, obtenu du département de sciences biologiques de l'université de Stanford (Palo Alto, CA, USA). L'obtention de nos souris mutantes pour Opn4 sur un fond génétique C57BL6/J (pur à 99%) a nécessité 9 générations d'un rétro-croisement F(n) X C57BL6/J. Le phénotype associé à une mutation génétique peut varier selon le fond génétique des animaux étudiés. Cette variation phénotypique est d'autant plus importante chez des individus hybrides, issus de fonds génétiques différents (typiquement 129Sv et C57BL6/J dans le cas de souris génétiquement modifiées). Il est donc nécessaire, afin de diminuer la variation inter-individuelle, de mener notre étude sur des animaux ayant un fond génétique « pur », à 99% C57BL6/J. Un second argument pour l'étude sur un fond C57BL6/J provient des connaissances éthologiques et comportementales générales chez la souris (Rodgers et al., 2002, Crawley 2007). Ces données ont été recueillies au cours des décennies par les neurosciences comportementales chez des souris sauvages de fond génétique C57BL6/J.
Dès leur naissance et jusqu’au moment du sevrage maternel aux environs de la 4ème semaine, nos souris continuent à être hébergées en zone transgénique. Pendant cette période notamment à partir de P10, les extrémités de leurs queues sont prélevées, congelées à -20°C et transmises par lot (généralement une même portée) à notre équipe pour permettre le génotypage de ces souris vis à vis du gène de la mélanopsine.
Dès leur transfert en zone expérimentale, les souris sont isolées socialement et disposées dans des cages individuelles de type 2 (L x l x h= 265x205x140 en mm) ou de type 2L (L x l x h= 365x205x140 en mm) pour celles, dont le sommeil est enregistré par ECoG et EMG. La nourriture sous forme de cylindres calibrés et normocaloriques, dont les caractéristiques sont 2.89 kcal/g, 14% kcal de lipide, 27% kcal de protide and 59% de glucides (SAFE 105; SAFE, Augy, France) et l’hydratation (eau dans un biberon de 250ml) sont mis à disposition, ad libitum, et disposées sur une grille au dessus de la cage. Les souris ont, dans des conditions physiologiques normales de stabulation en laboratoire, une consommation moyenne par 24h en nourriture de 15g par 100g de poids et en eau de 15ml par 100g de poids. L’approvisionnement en eau, en aliments calibrés (5g par cylindre) et le changement de la litière sont effectués une fois par semaine, au minimum, associés à un contrôle quotidien de la qualité de la stabulation et de l’état sanitaire des animaux.
Simultanément, nous procédons à une inversion des temps de lumière et d’obscurité par rapport au rythme habituel : lumière blanche de 19 h à 7 h et obscurité totale (sans lumière rouge) de 7 h à 19 h. Nous avons opté pour cette répartition de la lumière au cours du nycthémère, car nous souhaitions réaliser les tests comportementaux en phase d’obscurité (phase active, la nuit pour un
mammifère nocturne) qui est la phase d’activité d’une souris. Ceci nous paraissait plus approprié, plus pertinent et surtout plus proche de la réalité des signes cliniques de dépression mis en évidence chez l’humain qui s’observent et se manifestent plutôt pendant l’éveil (phase active, jour pour un mammifère diurne) que pendant le sommeil (phase de repos, la nuit chez un mammifère diurne). Cette période d’habituation dure trois semaines, elle permet d’observer les animaux, de vérifier leurs états sanitaire et physiologique et de les manipuler avant de débuter les tests expérimentaux.
Pendant les phases expérimentales d’exposition lumineuse modulée en fonction du paradigme choisi, les souris sont hébergées dans une armoire de grande capacité contrôlant l’humidité, la température (23°C ±1) et les modalités d’éclairage. Cette armoire ventilée a été conçue, à façon, par la société Charles River en collaboration avec son service d’ingénierie et la plateforme du Chronobiotron pour répondre à nos exigences expérimentales de contrôle de l’intensité lumineuse. Elle comporte deux compartiments indépendants, ventilés, dont l’éclairage est en cycle jour/nuit et qui disposent de dix emplacements chacun répartis sur cinq niveaux permettant de disposer deux cages par niveau. Le fond de l’armoire est équipé de barrettes de LED (Diode Electroluminescente) qui diffusent une lumière, blanche, homogène sans émission de chaleur, dont le cône d’éclairage orienté vers les cages en plexiglas est ouvert d’arrière en avant. Le fond comporte également un néon rouge amovible que nous retirons pour obtenir une période d’obscurité totale et pour éviter une intensité de lumière résiduelle délivrée par ce néon, même si chez la souris, la vision est bichromatique (la couleur rouge n’est pas perçue), le flux photonique persiste.
Grâce à la mise en place d’un variateur de lumière, l’intensité lumineuse délivrée dans chaque compartiment est programmable de manière indépendante, selon la gamme suivante :
Durée de l’impulsion (secondes)
Intensités mesurées dans la cage (lux) 1 600 2 50 3 150 4 300 5 450 6 600
La plus basse intensité obtenue dans l’armoire était de 50 lux, ainsi pour obtenir une condition dim light, nous avons disposé des films en plastic noir au fond de l’armoire laissant filtrer moins de 5 lux, l’homogénéité et l’intensité de l’éclairage étant contrôlées par des mesures itératives préalables à l’aide d’un luxmètre situé au milieu d’une cage vide, recouverte de sa grille chargée de nourriture et d’un biberon d’eau et posée à chaque emplacement potentiel dans le compartiment.
Les animaux nés, hébergés en zone transgénique et non susceptibles d’être utilisés dans le cadre de nos projets ou à des fins de reproduction et d’entretien de la lignée sont euthanasiées avant la fin du sevrage. Les animaux correspondant à nos critères sont transférés en zone expérimentale dès leur sevrage.
Cette étape a pour but de sélectionner les souris au sein d’une même portée, à savoir les souris sauvages (Opn4+/+), les souris mutantes hétérozygotes (Opn4+/-) et homozygotes (Opn4-/-) pour le gène de la mélanospine. Le protocole détaillé est en annexe 1. Brièvement, l'ADN génomique est extrait d'un morceau de queue de souris, purifié puis le locus du gène Opn4 est amplifié par réaction d'amplification en chaine (ou polymerase chain reaction – PCR). Les fragments d'ADN obtenus sont séparés lors de la migration sur un gel d'agarose puis visualisés lors de l’opération de révélation. Le fragment correspondant à l'allèle Opn4 sauvage (wild-type -
OPN4+/+) présente une taille de 289 paires de bases (bp), l'allèle muté une taille de
919 bp (figure 28).
L’allèle sauvage est analysé par les amorces suivantes :
Sens (Mel4E3) TCA-TCA-ACC-TCG-CAG-TCA-GC
Anti sens (Mel2E4) CAA-AGA-CAG-CCC-CGC-AGA-AG
L’allèle muté est analysé par les amorces suivantes
Sens (Todo Neo) CCG-CTT-TTC-TGG-ATT-CAT-CGA-C
Figure 28. Exmple de bandes d’intérêts après révélation lors du génotypage. M est une DNA Ladder 100bp de Fermentas®: