Analyses rapides

5.4.1. Séparation d’agents dopants

Une méthode a été développée pour la séparation d’un mélange de 9 agents dopants (un anti- inflammatoire, un stéroïde et divers diurétiques). La séparation a initialement été développée à température ambiante, puis les profils de gradient ont été adaptés pour les débits testés à l’aide du logiciel « HPLC calculator » [39]. Compte tenu de la masse molaire moyenne des composés du mélange (350g/mol), le débit optimal est de 400 µL/min à 30°C et la séparation dure 2.8 min (Fig. 22a). Comme attendu (Fig. 19), l’augmentation du débit de phase mobile (600, 800 et 1000 µ/min) (Fig. 22b-d) détériore significativement la séparation. Une perte de résolution est observée entre les pics 4 et 5 (dexaméthasone et furosémide), menant à une co-élution des pics.

Figure 22 : Séparation d’agents dopants à 30°C et à différents débits de phase mobile. Colonne : Acquity BEH Shield RP18 (50

x 2.1 mm, 1.7 µm) ; Phase mobile (gradient) : 0.1% acide formique dans eau – 0.1% acide formique dans acétonitrile ; Température : 30°C ; Volume d’injection : 1 µL ; D étection : UV@254 nm, 25 ms, 80 Hz ; Composés : (1) acétazolamide, (2) chlortalidone, (3) clopamide, (4) dexaméthasone, (5) furosémide, (6) indapamide, (7) bumétanide, (8) probénécide, (9) acide éthacrynique. (a) 400 µL/min ; (b) 600 µL/min ; (c) 800 µL/min, (d) 1000 µL/min.

La même séparation a été réalisée à haute température (i.e. 90°C) et à différents débits de phase mobile (600, 1000, 1500 et 1700 µL/min) (Fig. 23a-d). A cause des changements de sélectivité liés à l’augmentation de température, l’ordre d’élution des pics 4, 5 et 6 (dexaméthasone, furosémide et indapamide) a été modifié. Les profils de gradient ont donc été ré-optimisés en fonction de la température à l’aide du logiciel Osiris (Datalys, Grenoble, France). Dans les conditions optimales de séparation à 90°, tous les pics sont séparés indépe ndamment du débit, en particulier, grâce au bon transfert de masse à haute température (Fig. 19). Le temps d’analyse diminue significativement à haut débit (2.3 min à 600 µL/min vs 0.8 min à 1700 µL/min) et la séparation complète des 9 agents dopants a été réalisée en moins de 1 min à 90°C (Fig. 23d).

Figure 23 : Séparation d’agents dopants à 90°C et à différents débits de phase mobile. Colonne : Acquity BEH Shield RP18 (50

x 2.1 mm, 1.7 µm) ; Phase mobile (gradient) : 0.1% acide formique dans eau – 0.1% acide formique dans acétonitrile ; Température : 30°C ; Volume d’injection : 1 µL ; D étection : UV@254 nm, 25 ms, 80 Hz ; Composés : (1) acétazolamide, (2) chlortalidone, (3) clopamide, (4) dexaméthasone, (5) furosémide, (6) indapamide, (7) bumétanide, (8) probénécide, (9) acide éthacrynique. (a) 600 µL/min ; (b) 1000 µL/min ; (c) 1500 µL/min, (d) 17000 µL/min.

5.4.2. Séparation de trois agents anti-tuberculeux

Récemment, l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé) [54] a lancé une vaste campagne de lutte contre la tuberculose pour les prochaines années. Actuellement, on compte dans le monde une nouvelle infection par le bacille tuberculeux chaque seconde et un tiers de la population mondiale est infecté. La progression de souche de bacilles résistants à un ou plusieurs antibiotiques requiert une chimiothérapie longue et nécessite l’association de plusieurs antituberculeux. Les trois agents antituberculeux bactéricides principaux recommandés par les autorités internationales pour le traitement initial intensif sont la rifampicine (RIF), l’isoniazide (ISN) et le pyrazinamide (PYR), connu en Suisse sous la formulation Rifater®.

La Pharmacopée américaine (USP) propose une méthode de séparation par chromatographie liquide en 15 min (temps de ré-équilibrage non compris, env. 20 min) utilisant une colonne de 250 mm de long et 4.6 mm de diamètre interne. La méthode proposée par l’USP a été adaptée puis optimisée pour l’utilisation de colonnes dans les conditions UPLC et HT-UPLC (2.1 x 50 mm, 1.7 µm). La Fig. 24a montre la séparation effectuée au débit maximal supporté par l’instrument à 30°C (1 mL/min) en moins de 1.5 min. A 90°C, le débit a pu être augmen té davantage (1.4 mL/min), permettant d’obtenir

une séparation similaire en moins de 1 min. Le temps de ré-équilibrage pour ces méthodes rapides est d’environ 1 min.

Comme mentionné précédemment, l’UPLC ainsi que la HT-UPLC permettent de réduire drastiquement les temps d’analyse. Etant donné le nombre élevé d’analyses à effectuer pour le contrôle de qualité ou le suivi thérapeutique dans le cas du Rifater®, diminuer la durée de la procédure analytique est devenu une nécessité.

Figure 24 : Séparation d’une formulation de Rifater® reconstituée (RDF 100%). Colonne : Acquity BEH C18 (50 x 2.1 mm, 1.7

µm) ; Phase mobile (gradient) : tampon phosphate pH 7.0 – acétonitrile ; Volume d’injection : 2 µL ; Détection : UV@254 nm, 25 ms, 80 Hz ; Composés : (1) isoniazide, (2) pyrazinamide, (3) rifampicine. (a) T = 30°C, F = 1000 µL /min ; (b) T = 90°C, F = 1400 µL/min.

5.4.3. Séparation d’un cocktail pharmaceutique

Une colonne de 30 mm remplie de particules sub-2 µm a également été évaluée. D’un point de vue théorique, la réduction de la longueur de colonne induit une diminution du temps d’analyse, de l’efficacité et de la perte de charge (facteur 1.7 par rapport à une colonne de 50 mm). Bien que la réduction de la longueur permette de travailler à des débits plus importants, la perte en efficacité limite l’utilisation de telles colonnes aux mélanges simples, où la résolution n’est pas critique.

La séparation d’un cocktail pharmaceutique contenant 8 composés (benzodiazépines, analgésiques et barbituriques) a été développée à 30° et 90°C sur u ne colonne de 30 mm de long. Les conditions expérimentales optimales ont été déterminées aux deux températures de travail à l’aide d’un logiciel d’optimisation (Osiris, Datalys, Grenoble). La Fig. 25a présente la séparation optimale obtenue à 30°C au débit optimal de 600 µL/min (masse moléculaire moyenne de 250 g/mol). Dans ces conditions, la séparation n’est pas acceptable et la sélectivité entre les pics 4, 5 et 6 est insuffisante. Cependant,

grâce aux changements de sélectivité liés à la température, la séparation complète des pics est obtenue à 90°C (Fig. 25b) avec un temps d’analyse d e 40 s pour un débit de 2 mL/min (débit maximum applicable). Ce type de stratégie ne peut être utilisée que pour des mélanges simples, étant donné l’efficacité limitée, générée par ces colonnes courtes (N ≈ 6000 en mode isocratique).

Figure 25 : Séparation d’un cocktail pharmaceutique. Colonne : Acquity BEH Shield RP18 (30 x 2.1 mm, 1.7 µm) ; Phase

mobile (gradient) : 0.1% acide formique dans eau – 0.1% acide formique dans acétonitrile ; Volume d’injection : 1 µL ; Détection : UV@254 nm, 25 ms, 80 Hz ; Composés : (1) paracétamol, (2) phénazone, (3) phénobarbital, (4) méthylphénobarbital, (5) propyphénazone, (6) nitrazépam, (7) flunitrazépam, (8) diazépam. (a) T = 30°C , F = 600 µL/min ; (b) T = 90°C, F = 2000 µL/min.

5.5. Discussion

La stabilité de la colonne est un des principaux problèmes relevés en HTLC. La colonne utilisée en HT-UPLC (Acquity BEH Shield RP18) a démontré une bonne stabilité thermique à 90°C a près 500

injections (correspondant à 7500 volumes de colonne) dans des conditions de haute pression (∆P > 400 bars).

L’utilisation simultanée de la HTLC et de l’UPLC (HT-UPLC) est une stratégie prometteuse pour l’obtention de séparations ultra-rapides (moins de 1 min) sans perte de charge excessive sur des colonnes de 30 ou 50 mm. Cependant, le changement de sélectivité dû à l’élévation de la température peut être un facteur limitant et doit être considéré lors du développement de méthode.