Analyses physico-chimiques

Pour déterminer la teneur en eau, on a introduit dans chaque creuset en porcelaine de tare connue 5g d’échantillon de microalgue représentant ainsi le poids P. L’ensemble est mis dans une étuve (Memmert UF 110) réglée à 105±2°C pendant trois heures. Une pesée est effectuée pour avoir un poids P1. L’opération est répétée jusqu’à obtention d’un poids constant (Audigie et al., 1982). La teneur en eau (%) est donnée par la formule suivante:

Teneur en eau (%) = (P-P1) / M .100

 P : masse en g de la prise d’essai avant séchage.

 P1 : masse en g de la prise d’essai après séchage.

 M : masse du matériel biologique.

A partir de la teneur en eau, on détermine le taux de matière sèche qui est donné par la formule suivante :

Matériels et Méthodes

33 II.2. Taux de cendres

Le principe consiste en une incinération d’un échantillon de poudre de microalgue à une température de 900°C dans un four à moufle (Heraeus Instrument UK). L’opération ne sera terminée que lorsque la couleur des résidus deviendra blanche grisâtre et qui se transformera en une couleur blanche après refroidissement (Audigie et al., 1982).

La teneur en cendres (%) est donnée par la formule suivante: Teneur en cendres (%) = (B - A)/ M .100

 B : poids de creuset vide (g).

 A : poids de creuset + échantillon après l’incinération (g).

 M : poids de l’échantillon (g).

II.3. Détermination de la teneur en matières azotées totales ou protéines brutes

La teneur en protéines brutes est déterminée selon la méthode AOAC 981.10 qui fait appel à la méthode Kjeldahl réalisée sur trois étapes :

Minéralisation de la prise d’essai : environ 1 g de biomasse sèche dans un matras (ballon de minéralisation à long col), en présence de 20 ml d'acide sulfurique concentré et 2g de catalyseur mixte (sulfate de potassium et de cuivre) Le ballon est disposer sur la plaque de minéralisation, tel que son axe soit incliné par rapport à la verticale et sur son col un entonnoir dont le passage est fermé par une bille en verre. Le but de la minéralisation est de dégrader la matière organique azotée sous forme de sel d'ammonium ( ) utilisant un appareil à cet effet, le Speed Digester k-425.

Distillation de l’ion ammoniac : après avoir ajouté environ 160 ml d’eau distillée et quelques gouttes de phénolphtaléine, la solution est transférée dans le matras de l'appareil de distillation qui est relié à un réfrigérant par son extrémité haute. Ainsi une neutralisation a lieu par aspiration automatique de la soude à 33% et à cause du barbotage de l’air chaud l’ammoniac s’évapore pour être condensé sur les parois du réfrigérant et par la suite se précipite dans la fiole de réception de l'appareil à distillation, contenant 20 ml d’acide sulfurique à 0.1N comme liquide de récupération. La vérification de la neutralité du distillat se fait au moyen de papier pH, si la réaction est alcaline, la distillation est poursuivie sur l’appareil Buchi Unit k-355.

Titrage de l’ion ammonium présent dans la fiole de réception, par NaOH 0.1 N. La teneur en azote obtenue est exprimée en pourcentage de masse comme suit :

Matériels et Méthodes

34 Avec :

 T la normalité de la solution d'acide sulfurique utilisé pour le titrage ;

 V le volume en millilitres de la solution d'acide sulfurique nécessaire pour arriver au point d’équivalence (fin de titration)

 PE la masse en grammes de la prise d'essai

 La teneur en protéines brutes, exprimée en pourcentage de masse, se calcule en multipliant la teneur en azote par le facteur 5,95 (Lopez et al., 2010).

II.4. Dosage des sucres totaux

La méthode utilisée est celle de Fox et Robyt, 1991. Le principe repose sur les liaisons glycosidiques des sucres qui sont hydrolysées en milieu acide et à chaud en dérivés furfuraux qui se combinent facilement avec le phénol et donnent une coloration rougeâtre qui absorbe dans le visible (450-500 nm). Cette méthode permet de doser tous les glucides totaux d’un matériel biologique.

 Mode opératoire

1 g d’échantillon de N. gaditana est dispersé dans 10 ml de DMSO à 25% (v/v), et le mélange est ensuite incubé pendant 15 min au bain marie bouillant. Ce mélange (0.1 ml) est dilué dans 9.9 ml d’eau. A 0.5 ml de ce dernier on ajoute 0.5 ml de phénol (5%). Après homogénéisation, 2 ml de H₂SO₄ sont ajoutés, puis le mélange est incubé 30 min à température ambiante. La lecture est réalisée avec un spectrophotomètre (Shimadzu Scientific Instruments) Une gamme de glucose est réalisée dans les mêmes conditions que les échantillons (Annexe 01). Les essais sont faits en trois fois.

II.5. Teneur en matières grasses

Les lipides sont extraits en continu à l’hexane dans un appareil de Soxhlet. Ce dernier comporte 3 parties, respectivement de bas en haut, un ballon à col rodé, un extracteur recevant une cartouche et un réfrigérant à reflux. Environ 3g d’échantillon sont pesés dans une cartouche en carton poreux, après introduction de 150 ml de n-hexane pur dans le ballon à col rodé, la cartouche est déposée dans l’extracteur et les trois parties de l’appareil sont assemblées. L’hexane est alors porté à ébullition pendant 6h sur des plaques chauffantes jusqu’à obtention d’un maximum d’hexane dans l’extracteur. Le lipide extrait est mesuré après élimination du solvant en utilisant un évaporateur rotatif sous vide pour évaporer le n-hexane à 35°C pendant 60 minutes. La teneur en lipides est ainsi déduite (Sukarni et al., 2014).

Matériels et Méthodes

35 Le taux de matière grasse est calculé par la formule suivante :

 MG% : Taux de la matière grasse.

 P1 : Poids du ballon après évaporation.

 P2 : Poids du ballon vide.

 ME : Masse de la prise d’essai.