Analyses par Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 76

Les données recueillies par biopuce ont aussi été chargées dans l’application Ingenuity Pathway Analysis (IPA) dans le but de confirmer les résultats obtenus par GSEA et GO, en plus de permettre la visualisation des réseaux de gènes et des voies de signalisation différemment exprimés dans les cellules Th1Th17 versus Th1. Pour ce faire, chaque identifiant de gène de l’ensemble des données a été lié à son objet gène correspondant dans la base de données Ingenuity (Ingenuity Pathways Knowledge Base) avant de procéder à l’analyse fonctionnelle révélant les voies canoniques différemment exprimées (p<0.05). Parmi les 37 voies canoniques significatives identifiées par IPA, nous en avons sélectionnées 21 sur la base de leur intérêt potentiel dans le contexte de l’infection par le VIH (Fig. 13A). L’analyse fonctionnelle par IPA a réaffirmé une distinction dans les profils d’expression des gènes liés aux cytokines et chimiokines (voies #2, 3, 4 à partir du haut, Fig. 13A) ainsi qu’à la différenciation des lymphocytes T auxiliaires (voie #1) et a identifié à nouveau des voies liées à la migration et l’adhésion des cellules T (voies #12, 14, 16) et à la prolifération (voies #5, 10). Plus spécifiquement, les voies de signalisation et de production de l’IL-15 (voies #7, 20) apparaissent aussi toutes deux différemment régulées dans les cellules Th1Th17 versus Th1. La cytokine IL-15 qui fait partie de la famille de l’IL-2 stimule la prolifération et les fonctions effectrices des cellules T et NK (358). Diverses voies de signalisation sont aussi identifiées dont la voie ERK/MAPK (voie #8) liée entre autres à la division cellulaire (396), la signalisation Nur77 (voie #13) impliquée dans l’apoptose (397), la signalisation via p38 MAPK connue pour son rôle dans la sénescence due au stress (398), ainsi que la voie PKCƟ (voie #15) pouvant promouvoir la différenciation des cellules T vers un profil de polarisation Th17 (399). Finalement, plusieurs voies canoniques liées à la famille PPAR (peroxisome proliferator- activated receptor) ou au RXR (récepteur X des rétinoïdes), deux molécules formant un complexe hétérodimère, ainsi qu’au RAR (récepteur des acides rétinoïques) sont aussi différemment régulées (voies #9, 17, 19, 21) et connues pour jouer un rôle dans la différenciation cellulaire et l’inflammation (400).

Suite à cette analyse fonctionnelle, nous avons utilisé IPA afin de superposer les résultats d’expression de gènes obtenus par biopuce, soit à des figures de voies de signalisation d’intérêt pré-existantes dans le logiciel (Fig. 13 B-C, E) soit à des réseaux moléculaires générés

77 algorithmiquement en fonction de leur connectivité (Fig. 13 D, F). Le schéma de différenciation des cellules T CD4+ illustre bien l’expression différentielle des principaux marqueurs liés au profil Th17 (RORC, IL-17A, IL-17F) dans les cellules Th1Th17 versus Th1, en plus de relever l’expression à la hausse des molécules CD28, CD40L et IL-2 pouvant résulter en une susceptibilité accrue à l’activation cellulaire et favoriser la prolifération (355) (Fig. 13B). En plus des cytokines liées au profil Th17, la figure suivante résumant l’implication des cytokines dans la médiation de la communication entre les cellules du système immunitaire fait ressortir l’expression préférentielle des interleukines IL-15, IL-22 et IL-26 dans les cellules Th1Th17 (Fig. 13C). L’IL-15 est importante pour stimuler la réponse des cellules NK (358), alors que l’IL-22 et l’IL-26 favoriseraient la réponse immunitaire au niveau des muqueuses, notamment à la muqueuse intestinale (255, 256, 401, 402).

Le réseau moléculaire des principaux gènes impliqués dans l’inflammation créé à partir des gènes différemment exprimés dans les cellules Th1Th17 versus Th1 (Fig. 13D) inclus plusieurs cytokines et récepteurs à cytokines (e.g. IL-22, IL-23R, CXCL10, TNFRSF25) et reprend certaines des informations contenues dans les voies précédentes (e.g. RORC, CD80, CD40L) (Fig. 13 B-C). La majorité des molécules incluses algorithmiquement à ce réseau moléculaire sont exprimées à la hausse dans les Th1Th17 (64/87). D’intérêt, ce réseau fait aussi ressortir l’expression préférentielle dans les Th1Th17 de deux récepteurs de la famille PPAR (alpha et gamma), ainsi que du gène ARNTL (Fig. 13D, en haut à droite). Les PPAR sont des récepteurs nucléaires qui, lorsque activés, agissent comme des facteurs de transcription (403). Comme le montre la voie de signalisation des PPARs (Fig. 13E), PPARα est entre autres impliqué dans le métabolisme des acides gras, alors que PPARγ joue un rôle dans la différenciation des adipocytes et le métabolisme du glucose. PPARγ est toutefois aussi connu pour ses propriétés anti-inflammatoires (359) et plus récemment pour sa capacité à diminuer la réplication du VIH dans les macrophages (404). Quant au gène ARNTL (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like), il serait impliqué dans le maintien du rythme circadien via notamment son interaction avec le gène CLOCK (364) (Fig. 13F). Cependant, des travaux de Wang et al. indiquent aussi des interactions directes ou indirectes entre les PPARs, ARNTL et AhR (aryl hydrocarbon receptor) (405), un récepteur cytoplasmique dont l’activation favorise la différenciation des lymphocytes T vers le profil Th17 (406).

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Figures - Section 4.2.2

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B

Figure 13. Voies canoniques et réseaux moléculaires différemment exprimées dans les cellules Th1Th17 versus Th1 déterminés par Ingenuity Pathway Analysis. Les niveaux d’expression de 38

113 ensembles de sondes dans les cellules Th1Th17 et Th1 de quatre donneurs non infectés par le VIH ont été obtenus par biopuces Affymetrix. Ces résultats ont été téléchargés vers le logiciel Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Ingenuity Systems Inc.) où chaque identifiant de gène a été lié à son objet gène correspondant dans la base de données Ingenuity. A. L'analyse fonctionnelle a identifié les voies canoniques différemment exprimées (p<0.05) face à l'ensemble des données. Parmi celles-ci, 21 ont été sélectionnées sur la base de leur valeur p et de leur intérêt potentiel dans le contexte de l’infection à VIH. L’axe des x représente les pourcentages de gènes régulés à la hausse (en rouge), à la baisse (en vert) ou absents de l’ensemble des sondes (en blanc) chez les Th1Th17 versus Th1, ainsi que le –log (p-value) calculé par le test exact de Fisher d’extrémité droite (en orange) pour chaque voie canonique. Les nombres adjacents à chaque voie canonique représentent le nombre total de gènes qui y sont inclus. (B-F) Les résultats obtenus par biopuces ont été superposés à des réseaux moléculaires développés à partir des informations contenues dans Ingenuity sous la forme de voies de signalisation pré-existantes dans la base de données ou de réseaux d’interactions générés algorithmiquement à partir d’un gène d’intérêt sélectionné. Les gènes exprimés à la hausse (en rouge) ou à la baisse (en vert) dans les cellules Th1Th17 versus Th1, les gènes détectés avec différence non significative (en gris) et les gènes exprimés de façon identique ou non présents sur la biopuce (en blanc). B. Gènes associés à la différenciation des cellules T CD4+ vers les profils de polarisation Th1, Th2, Th17, Treg et Tfh.

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C

Figure 13 (suite). Voies canoniques et réseaux moléculaires différemment exprimés dans les cellules Th1Th17 versus Th1 déterminés par Ingenuity Pathway Analysis. C. Rôle des cytokines

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D

Figure 13 (suite). Voies canoniques et réseaux moléculaires différemment exprimés dans les cellules Th1Th17 versus Th1 déterminés par Ingenuity Pathway Analysis. D. Réseau moléculaire

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E

Figure 13 (suite). Voies canoniques et réseaux moléculaires différemment exprimés dans les cellules Th1Th17 versus Th1 déterminés par Ingenuity Pathway Analysis. E. Voie de

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F

Figure 13 (suite). Voies canoniques et réseaux moléculaires différemment exprimés dans les cellules Th1Th17 versus Th1 déterminés par Ingenuity Pathway Analysis. F. Réseau moléculaire

des principales interactions du facteur de transcription ARNTL (Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like).

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