Analyses cytologiques

65 (31,29mg/l) (Sigma), en L-Cystéine (17,56mg/l) (Sigma) et avec 100μCi de méthionine[ 35S] (Perkin Elmer). L’incubation se poursuit pendant deux { trois heures { 35°C sous atmosphère enrichie en CO2 (5%). Après l’incubation, le milieu est éliminé, les tissus sont prélevés, puis broyés dans du tampon C. L’incorporation de la méthionine [35S] est déterminée par précipitation { l’acide trichloroacétique (TCA) 20% et par filtrage { l’aide d’un filtre GF/A (Whatman). La mesure de la radioactivité a été réalisée { l’aide d’un compteur { scintillation (Beckman LS6000TA).

II. Analyses cytologiques

1. Préparation des spermatozoïdes

Le comptage des spermatozoïdes, est réalisé en cellule de Malassez, après qu’ils aient été dilués au 1/50ème dans du milieu M2. Ce dernier est ensuite éliminé par centrifugation à 300g durant 5 minutes et le culot repris dans du PBS 1X de façon à avoir par la suite 50 000 spermatozoïdes pour l’étalement par lame. Après un séchage d’une heure et demi, les spermatozoïdes sont fixés au paraformaldéhyde 4% (V/V) durant 15 minutes puis lavés trois fois au PBS 1X. Les étalements sont enfin laissés à sécher durant deux heures et conservé { 4°C jusqu’{ leur utilisation en présence de sachets contenant des agents dessicants.

2. Test de viabilité

Un volume de 20 µl de la suspension des spermatozoïdes est mélangé avec 20 µl d’éosine puis agité pendant 30 secondes. On ajoute ensuite { ce mélange 30 µl de nigrosine puis on agite de nouveau. A l’aide d’une lame, on réalise un frottis { partir de quelques microlitres sur une lame et on laisse sécher { l’air pendant 5 minutes. On observe au microscope. Les spermatozoïdes morts sont colorés en rose et les spermatozoïdes vivants en blanc.

MATERIELS ET METHODES

Tableau M7: Dilutions et propriétés d’utilisation des anticorps en Immunofluorecence

sur spermatozoïdes.

Immunohistochimie

sur spermatozoides ^{Acide kynureninque 3-hydroxykynurenine}

Inhibition des

peroxydases endogènes ^{H2O2 0,3% Non}

Perméabilisation ^Non PBS Triton 0,1%

Saturation ^{PBS-NGS 1,5% Triton 0,1%} PBS NGS 1,5%

Anticorps primaire

Anti KYNA au 1/2000 ème Germacbio APO62 fait chez

le lapin (Anticorps

polyclonaux)

Anti 3-OHK au 1/500ème Novus NB100-597 fait chez la

souris (Anticorps

monoclonaux)

Anticorps secondaire

Anti lapin biotinylé au 1/500ème

Jackson immunoresearch,ref 111-065-003 fait chez la

chèvre

Ant souris couplé { l’alexa 488 au 1/1000ème

Invitrogen, A11017 fait chez la chèvre

Amplification Oui Non

Marquage Hoechst Hoechst au 1/1000ème dans

du PBS ^{Hoechst au 1/1000}

ème dans du PBS

Matériels et méthodes

66 3. Estimation de la présence de leucocytes dans le fluide séminal

La recherche et la numération des leucocytes dans le fluide séminal de la queue sont évaluées par le kit commercial Leucoscreen TM kit (FertiPro NV, Belgium). La technique est basée sur la réaction à la peroxydase. Cette dernière va colorer en rouge brun les globules blancs présent dans le fluide. Le protocole consiste à préparer une solution de travail dans un tube test, à partir de solution de diaminobenzidine (DAB) et d’une goutte de péroxydase (fournis dans le kit). Dans un tube, on ajoute { cette solution, 20 µl d’échantillon frais (le fluide séminal) puis une goutte de solution réactive (fourni avec le kit). On place 10 µl de ce mélange entre lame et lamelle pour observation au microscope et comptage.

On compte les cellules brunes et les spermatozoïdes présents dans le même champ d’observation. La proportion de leucocytes observée est rapportée au nombre total des spermatozoïdes observés.

4. Coloration de Shorr

La coloration de Shorr est utilisée pour mettre en évidence des anomalies morphologiques des spermatozoïdes. Les spermatozoïdes (80 000/lame) sont étalés délicatement puis séchés { l’air pendant 30 minutes. Les lames sont ensuite passées { l’éthanol 70° pendant 1 minute, puis rincées 2 minutes { l’eau courante. A la suite de ces étapes, les spermatozoïdes sont colorés durant 3 minutes { l’hématoxyline de Mayer (Sigma) et l’excès de colorant est éliminé par un lavage de 3 minutes { l’eau courante.

Après deux passages d’une minute dans l’éthanol { 70°, puis { 95°, les lames sont ensuite placées dans le colorant de Shorr (Merck) pendant 1 minute. Plusieurs bains successifs d’une minute chacun sont effectués : un dans de l’éthanol 95°, deux dans de l’éthanol 100°, et enfin un dans de l’xylène. Le montage est réalisé avec 3 gouttes de Cytoseal 60. Puis, une lamelle préalablement trempée dans l’histoclear est déposée en évitant la formation de bulles. L’observation est réalisée au microscope Zeiss Axio Plan 2. Les morphologies normales et anormales sont comptabilisées.

MATERIELS ET METHODES

Tableau M8 : Conditions réactionnelles pour la RT-PCR. Cdt° PCR x1 cDNA 0,75 μl Oligo5’ 0,5 μl Oligo3’ 0,5 μl dNTP 0,5 μl Tampon 5X ^{4 μl} MgCl2 2 μl TAQ 0,1 H2O 11,65μl QSP20μl 20 μl

Matériels et méthodes

67 5. Immunofluorescence sur spermatozoïdes

Les lames comportant l’étalement de spermatozoïdes sont dans un premier temps réhydratées durant 5 min dans du PBS 1X. Puis les spermatozoïdes sont perméabilisés ou non afin de faciliter l’accès de l’anticorps { l’antigène. Les peroxydases endogènes sont ou non inhibées selon les anticorps primaires et si une amplification doit être effectuée. Après deux lavages en PBS 1X, les lames sont incubées avec un tampon de saturation qui diffère selon la molécule marquée. L’anticorps primaire est déposé et incubé une nuit { 4°C en chambre humide. Après lavage, l’anticorps secondaire correspondant est appliqué pendant 1 heure en chambre humide à température ambiante. Dans certains cas, une amplification similaire à celle effectuée sur les tissus est réalisée avant la révélation. Afin de visualiser les noyaux, un marquage avec le Hoechst, est effectué.

Dans certains cas, un marquage au Mitotracker permet d’observer la localisation des mitochondries dans la pièce intermédiaire du spermatozoïde. Le détail des différentes spécificités du protocole pour chaque anticorps est donné dans le Tableau M7. Après avoir été montées en PBS/Glycérol et luttées, les lames sont observées { l’aide d’un microscope Zeiss Axio Plan 2. Certaines d’entres elles sont observées au microscope confocal (LSM 510). Les images ont été traitées avec les logiciels Axiovision LE et/ou Image J.