3-2- Analyses par Chromatographie sur Couche Mince (CCM) analytique Principe Principe

La chromatographie sur couche mince est une méthode couramment utilisée en phytochimie. Son principe, qui est celui de toute chromatographie, repose sur la séparation de mélanges en leurs divers composants. Elle se base sur la différence d’affinité des composants à l’égard de deux phases : la phase stationnaire solide (qui fixée sur une plaque, peut être la silice, la cellulose, l’alumine ou le polyamide…) et la phase mobile qui est un solvant ou un mélange de solvant. La CCM est d’utilisation très simple et s’effectue à des fins surtout analytiques d’un mélange. Elle permet de recourir très facilement à des réactifs chimiques pour la détection, la caractérisation et l’augmentation du seuil de détection de certaines molécules.

Mode opératoire

Généralement, une petite quantité de l’échantillon à étudier est déposée sur la phase fixe et mise au contact de la phase mobile. Celle-ci migre par capillarité du bas vers le haut, entrainant avec lui les composants de l’échantillon. Cette migration est appelée élution et permet la séparation des différents composants de l’échantillon. Chaque composant migre à une hauteur donnée et le rapport entre la distance parcourue par le composant et celle parcourue par la phase mobile est appelé rapport frontal (Rf), caractéristique de chaque molécule.

62 Les extraits aqueux et éthanolique de N. velutina ont été dissouts dans le méthanol (extrait éthanolique) ou le mélange eau/méthanol 60:40 (extrait aqueux) à une concentration finale de 50 mg/mL. A l’aide d’un tube capillaire, 50 µL de chacun des extraits était déposé sur une plaque finie de silice 60 F254 prête à l’emploi. La plaque après séchage du dépôt, était éluée dans un mélange eau/méthanol/acide acétique (12,5/12,5/1) pour l’extrait aqueux et un mélange éther de pétrole/acétate d’éthyle (50/50) pour l’extrait éthanolique. Après élution et séchage des plaques, celles-ci étaient révélées soit en UV aux longueurs d’onde de 254 et 366nm soit à l’aide de révélateurs chimiques comme l’indique le tableau I.

63 Tableau I : Récapitulatif des révélateurs de plaques de CCM

Réactifs Composés révélés Mode opératoire

Anisaldéhyde sulfurique [176]

Réactif polyvalent Une solution de p-anisaldéhyde à 0,5% a été préparée dans un mélange de méthanol/acide acétique/acide sulfurique (85 :10 :5). Puis pulvérisée sur la plaque. Après un chauffage intense, les composés organiques apparaissent sur la plaque sous forme de taches colorées en lumière du jour.

Dragendorff modifié selon Munier [177]

Alcaloïdes Un volume d’une solution de 17g de sounitrate de bismuth et 200 g d’acide tartrique dans 800 mL d’eau a été mélangé avec un volume d’une solution de 160 g d’iodure de potassium dans 400 mL d’eau. Cinquante millilitres de cette solution ont été dilués extemporanément dans 500 mL d’eau. Cent grammes d’acide tartrique ont ensuite été dissouts dans la dilution qui était pulvérisée sur la plaque. Perchlorure

de fer [178]

Polyphénols Une solution de FeCl3 à 10% a été préparée dans un mélange méthanol/eau (1:1) puis vaporisée sur la plaque. Les polyphénols apparaissent sous forme de taches de couleur en lumière du jour.

Neu [178] Flavonoïdes Une solution de diphénylborate d’éthanolamine à 1% a été préparée dans le méthanol. Cinq pour cent de PEG 4000 (polyoxyéthylène glycol 4000) y ont été ajoutés et la solution, vaporisée sur la plaque. Les flavonoïdes apparaissent sous forme de taches fluorescentes orange, jaune, bleu et vert à 366 nm. Diméthylamino-cinnamaldehyde (DMACA) Proanthocyanidines (tannins cathéchiques)

Deux grammes de p-diméthylaminocinnaldéhyde ont été dissouts dans 100 mL de méthanol puis 3,5 mL d’acide chlorhydrique concentré y ont été ajoutés. Le mélange a été vaporisé sur la plaque. Les tannins apparaissent sous forme de taches vertes (catéchines) ou bleues (proanthocyanidines) selon leur nature chimique.

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazile (DPPH) [179]

Composés anti-radicalaires

Une solution méthanolique de DPPH a été préparée à 2mg/mL et la plaque était trempée dans la solution pendant 5 secondes. Les composés anti-radicalaires apparaissaient en jaune sur la plaque.

64 II-3-3- Chromatographie Liquide sous Haute Pression

Principe et description du dispositif

Globalement, la Chromatographie Liquide sous Haute Pression (CLHP) repose sur le même principe que la CCM qui consiste en la séparation de mélanges en leurs divers composants en fonction de leur affinité pour les différentes phases (mobile et stationnaire). Au-delà de son coût plus élevé, de sa complexité d’utilisation, de la nécessité de prendre davantage de précautions ; son avantage est l’amélioration de la résolution et du seuil de détection des composés. Les éléments constituant un système CLHP classique sont : un système de pompage pouvant être simple ou multiple et servant à déplacer la phase mobile à haute pression (2-300 bars); un injecteur pouvant être manuel ou automatique et servant à introduire dans le système à haute pression, l’échantillon préalablement filtré (pour éviter de boucher les colonnes); une colonne à granulométrie très fine contenant la phase stationnaire et responsable de la bonne résolution de la CLHP; un détecteur ultraviolet et une interface de visualisation des signaux enregistrés par le détecteur.

Mode opératoire

Les extraits totaux de N. velutina dissouts dans le méthanol (extrait éthanolique) ou le mélange eau/méthanol 60:40 (extrait aqueux) à une concentration finale de 50 mg/mL, ont été filtrés à 0,45 micron puis injectés dans un système CLHP de marque shimadzu, composé de deux pompes LC-10AS, d’un détecteur UV SPD-10AS à deux longueurs d’onde et d’un module de contrôle 10Avp. Tous ces éléments étaient pilotés à travers le logiciel LC solution grâce auquel on pouvait visualiser le chronogramme obtenu après injection de l’extrait. La colonne utilisée ici était une vision HT C18 HL (250 mm x 4,6 mm, 5 µm) et les deux solutions d’élution étaient, l’acétonitrile et le mélange eau/acide acétique à 0,3%. Les gradients d’élutions des deux extraits sont consignés dans le tableau II :

65 Tableau II : Gradients d’élution des extraits totaux de N. velutina en CLHP

Extrait aqueux Extrait éthanolique

Intervalle de temps (min) Acétonitrile (%) Intervalle de temps (min) Acétonitrile (%)

1-10 00 1-10 50 10-15 00 10-15 50 15-20 5 15-20 50 20-25 5 20-25 75 25-35 10 25-30 75 35-50 20 30-45 100 50-60 100

II-4- EVALUATION DE LA CAPACITE ANTIOXYDANTE IN VITRO DES EXTRAITS