Une masse pr´ed´etermin´ee de l’´echantillon a ´et´e utilis´ee pour d´eterminer la teneur en eau, la teneur en solides totaux et la teneur en cendres. Ensuite, une partie de l’´echantillon, a ´et´e soumise `a une extraction avec un solvant organique afin d’´eliminer les substances extractives (mati`eres grasses et prot´eines) et de d´eterminer leur teneur conform´ement aux
Deuxi`eme partie : Mat´eriels & M´ethodes Analytiques Chap.IV. 50 60 70 80 90 100 Proportion (%) 0 10 20 30 40 50 1 0.5 0.25 0.125 < 0.125 Ouverture de tamis (mm)
Figure 4.2 – Distribution des tailles des particules
m´ethodes d’analyses standards. Apr`es extraction, les ´echantillons ont ´et´e r´ecup´er´es et utilis´es pour d´eterminer la teneur en lignine, en cellulose, en h´emicelluloses et en sucres r´educteurs. Les analyses chimiques des ´echantillons ont ´et´e r´ealis´ee, en triples, par les m´ethodes d’analyses ”LAP de NREL” et autres m´ethodes d’analyses. Les r´esultats pour les diff´erents param`etres chimiques sont exprim´es par rapport `a la mati`ere s`eche (MS). 4.3.1 D´etermination du pH
Le potentiel hydrog`ene de grignon d’olive en suspension a ´et´e d´etermin´e `a l’aide d’un pH m`etre (HANNA) selon la m´ethode d´ecrite par AFNOR (1986). Les valeurs du pH ont ´et´e d´etermin´ees en dispersant une prise d’essai de grignons d’olive dans un volume d’eau distill´ee. Une fois filtr´e, la mesure a ´et´e r´ealis´ee en trois r´ep´etitions.
4.3.2 D´etermination de la teneur en eau et des solides totaux (NREL/TP- 510-42621)
La teneur en eau et en solides totaux a ´et´e d´etermin´ee par dessiccation de 2 g de grignon d’olive, dans une ´etuve isotherme `a une temp´erature de 105 oC, jusqu’`a l’obtention d’une
masse constante de l’´echantillon [74]. La teneur en solide totaux (%) et la teneur en eau (%), a ´et´e calcul´e comme suit (Equ.4.1, Equ.4.2) :
Totale des solides (%) = M assecreuset+Echantillon sec− M assecreuset M asseEchantillon
∗ 100 (4.1) Teneur en eau (%) = 100 − [M assecreuset+Echantillon sec− M assecreuset
M asseEchantillon
∗ 100] (4.2) 4.3.3 D´etermination de la teneur en cendres (NREL/TP-510-42622)
La teneur en cendre a ´et´e d´etermin´ee en utilisant la m´ethode analytique LAP [67]. Elle est exprim´ee en pourcentage de r´esidu restant apr`es incin´eration d’un ´echantillon sec 600
oC pendant 24 ± 6 heures. La teneur en cendre est calcul´e sur la base de l’´echantillon
s´ech´e `a l’air ((Equ.4.3))
Teneur en cendre (%) = M assecreuset+cendre− M assecreuset
P S ∗ 100 (4.3)
4.3.4 Teneur en mati`eres grasses r´esiduelle
La teneur en mati`ere grasse r´esiduelle a ´et´e d´etermin´ee `a l’aide de la m´ethode de Soxhlet, avec l’hexane comme solvant d’extraction [71]. La teneur en lipides r´esiduels est calcul´e ainsi (Equ.4.4) :
Teneur en lipides (%) = masse de lipides extraits (g)
poids de l’´echantillon (g) ∗ 100 (4.4) Apr`es extraction des mati`eres grasses r´esiduelles, les ´echantillon ont ´et´e lav´es par l’eau distill´ee, afin d’´eliminer le solvant r´esiduel. ensuite, ils ont ´et´e s´ech´es dans une ´etuve `a 70
oC pendant 24 heures.
4.3.5 Teneur en prot´eine
La teneur en prot´eine a ´et´e d´etermin´ee par la m´ethode de Bradford. Cette m´ethode utilise le r´eactif colorant de ”bleu de Coomassie brillant” et repose sur l’interaction entre le colorant et les acides amin´es des chaˆınes lat´erales des prot´eines `a pH acide. Cette interaction provoque le d´eplacement de l’´equilibre du colorant vers la forme anionique, une coloration bleue est obtenue, qui absorbe fortement `a 595 nm [7, 81]. Un ´echantillon est ajout´e au r´eactif, apr`es une courte incubation, la couleur bleue r´esultante est mesur´ee `
a 595 nm par un spectrophotom`etre UV-Vis par rapport `a l’eau distill´ee. La concentration en prot´eine a ´et´e d´etermin´ee `a l’aide de la courbe d’´etalonnage (Fig.4.3).
courbe d'étalonnage proteine
conc 595 465 PLA1 *10 20 0.29 0.101 1.2 40 0.38 0.201 60 0.55 0.245 80 0.676 -0.288 174 100 0.802 -0.352 120 0.918 -0.398 154 140 1 01 -0 401 140 1.01 -0.401 160 1.078 -0.413 180 1.17 -0.483 y = 0.005x + 0.199 R² = 0.987 1 1.2 1.4 m 0.4 0.6 0.8 A 595 nm 0 0.2 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Concentration en protéines (µg/ml)
Figure 4.3 – Courbe d’´etalonnage reliant la concentration en prot´eine `a l’augmentation d’absorbance `a 595 nm
Deuxi`eme partie : Mat´eriels & M´ethodes Analytiques
Chap.IV.
4.3.6 D´etermination de la teneur en lignine soluble et insoluble (NREL/TP- 510-42618)
La lignine constitue une partie importante des ´echantillons de biomasse. Ce constituant doit ˆetre mesur´e dans le cadre d’une analyse compl`ete de la biomasse. Les teneurs en lignine soluble et insoluble ont ´et´e d´etermin´ees selon la m´ethode LAP [75]. Cette m´ethode utilise une hydrolyse acide en deux ´etapes pour fractionner la biomasse en formes plus faciles `a quantifier. La lignine se fractionne en mati`ere insoluble dans l’acide et en mati`ere soluble dans l’acide. La lignine insoluble dans l’acide - r´esidu restant sur un creuset filtrant `
a porosit´e moyenne apr`es une hydrolyse en deux ´etapes, avec correction pour les cendres insolubles dans l’acide et les prot´eines insolubles dans l’acide, qui doivent ˆetre prises en compte lors de l’analyse gravim´etrique. La lignine soluble dans l’acide est mesur´ee par spectroscopie UV-Vis. La teneur en r´esidus insolubles (en pourcentage) dans l’acide (RIA) et la lignine insoluble dans l’acide (LIA), sont calcul´ees ainsi (Equ.4.5 et Equ.4.6) :
RIA (%) = M assecreuset+RIA− M assecreuset P S´echantillon
∗ 100 (4.5)
LIA (%) = (M assecrst+RIA− M assecrst) − (M assecreuset+cendre− M assecrst) − M asseprot P S´echantillon
∗100 (4.6) O`u :M asseprot : est la masse en prot´eine dans l’´echantillon et M assecrst est la masse
de creuset.
La teneur en lignine soluble (LSA) est calcul´ee ainsi (Equ.4.7) LSA (%) = U Vabs∗ V olumef iltrat∗ Dillution
ε ∗ M asseechantillon∗ Longueur du trajet
∗ 100 (4.7)
O`u : U Vabs : absorbance de l’´echantillon `a la longueur d’onde appropri´ee ;
ε : coefficient d’extinction pond´eral (g−1.L.cm−1) ;
Longueur du trajet : longueur de trajet de la cellule UV-Vis en cm M asseechantillon; en mg
La quantit´e totale de lignine (Equ.4.8) :
Lignine (%) = LIA (%) + LSA (%) (4.8)
4.3.7 D´etermination de la teneur en h´emicelluloses et en cellulose
La teneur en h´emicelluloses et en cellulose ont ´et´e d´etermin´ee selon la m´ethode de Goering and Van Soest (1975) [39] et Van Soest and Wine (1967) [70], `a partir du r´esidu insoluble au d´etergent neutre (NDF), du r´esidu insoluble au d´etergent acide (ADF) et du r´esidu insoluble au d´etergent acide et au H2SO4 `a 72 % (ADL). Le reflux d’un ´echantillon
avec une solution d´etergente acide ´elimine les substances solubles dans l’eau et autres que le composant fibreux. La fraction insoluble dans le r´eactif d´etergent acide (ADF) est pes´e apr`es filtration et s´ech´e `a 100oC. Cette fraction est trait´e avec une solution H
2SO4 `a 72%
puis filtr´ee `a travers un papier filtre Wattman pr´e-pes´e, s´ech´e et incin´er´e. La perte de
poids donne le d´etergent acide lignine (ADL). La teneur en cendre et en h´emicelluloses est d´emin´ee comme suit :
N DF = h´emicellulose + cellulose + lignine + cendre (4.9)
ADF = Cellulose + Lignine + cendre (4.10)
Hemicellulose = N DF − ADF (4.11)
Cellulose = ADF − R´esidu apr`es extraction avec H2SO4 72% (4.12)
Lignine = R´esidu apr`es extraction avec H2SO4 72% - cendres (4.13)
4.3.8 D´etermination de la teneur en sucre r´educteur et non-r´educteur
La teneur en sucres r´educteur et non r´educteur a ´et´e d´etermin´ee par la m´ethode ” the phenol-sulfuric acid assay ” [63,71,80]. La d´etermination des sucres avec cette m´ethode est bas´ee sur l’absorbance `a 490 nm d’un compos´e aromatique color´e form´e entre le ph´enol et le carbohydrate. Cette m´ethode est pr´ecise `a ± 2%. La teneur en sucre (g) a ´et´e d´etermin´ee `
a l’aide de la courbe d’´etalonnage (Fig.4.4). La concentration en sucre peut ˆetre rapport´ee en mol/g `a l’aide de la relation4.14, et ou en pourcentage, `a l’aide de la relation 4.15
0 0 50 0.111 0.86‐0.87 100 0.154 150 0.217 200 0.296 250 0.35 0.25 0.3 0.35 0.4 y = 0.001x + 0.018 R² = 0.986 0 05 0.1 0.15 0.2 A 490 nm R 0.986 0 0.05 0 50 100 150 200 250 300 Concentration de glucose (µg/ml)
Figure 4.4 – Courbe d’´etalonnage reliant la concentration en glucose `a l’augmentation de l’absorbance `
a 490 nm.
Concentration (mol/g) = x(g)
M (g/mol) ∗ m(g) (4.14)
pourcentage de sucre(% en poids) = x(g)
m(g) ∗ 100 (4.15)
O`u ; x est la masse en (g) du sucre d´eduit de la courbe d’´etalonnage, M(g/mol) repr´e- sente la masse du monosaccharide (glucose) dans l’´echantillon, et m est la masse (g) de l’´echantillon.
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