Analyses biologiques

2.2.1. Culture cellulaire

Les cellules sont entretenues dans des boîtes de culture à fond plat T75 cm² provenant de la société Corning et placées dans une étuve thermostatée à 37°C sous une atmosphère humide à 5% de CO2. A chaque passage, les cellules sont lavées avec une solution de phosphate salin 1X stérile, puis une solution de trypsine (TrypLE Express, Gibco) est déposée pour détacher les cellules de la boîte. La boîte est alors placée dans l’incubateur environ 5 minutes, le temps nécessaire pour que l’enzyme hydrolyse les protéines membranaires des cellules au niveau des résidus lysine et arginine. Du milieu de culture est ajouté dans la boîte afin de stopper l’activité de l’enzyme. Les cellules sont ensuite dissociées et homogénéisées, puis une fraction de cette solution est remise dans une nouvelle boîte de culture contenant du milieu de culture frais.

2.2.1.1. Culture des cellules endothéliales (HUVEC)

Les cellules endothéliales (HUVEC : Human Umbilical Vein Endothelial Cell, Promocell) sont cultivées (passages 4 à 6) dans le milieu de culture « Endothelial cell growth medium » (Promocell) supplémenté avec 1% d’antibiotiques pénicilline/streptomycine (GibcoBRL) à 100 µg/mL et 12.5 mL de « Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix C-39215 » (Promocell).

2.2.1.2. Culture des fibroblastes (3T3)

Les fibroblastes de souris NIH 3T3 (ATCC, Etats Unis) sont cultivés (passages 4 à 6) dans le milieu de culture « DMEM High glucose » (GE Healthcare LifeSciences)) 4.5 g/L de glucose supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF) (v/v) (GibcoBRL) et 1% d’antibiotiques pénicilline/streptomycine (v/v) (GibcoBRL).

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2.2.1.3. Culture des cellules Ptk2

Les cellules épithéliales de rein de kangourou, PtK2 (« Potorous Tridactylis Kidney », ATCC), sont cultivées (passages 6 à 10) dans le milieu de culture « Eagles Minimum

Essential Medium » (EMEM, de ATCC) supplémenté avec 10% de SVF (v/v) et 1% d’antibiotiques pénicilline/streptomycine (v/v).

2.2.1.4. Culture des fibroblastes gingivaux humains (HGF)

Les fibrobastes gingivaux humains (HGF, Human Gingival Fibroblast) sont cultivés (passages 8 à 13) dans le milieu de culture « DMEM low glucose » (GibcoBRL) supplémenté avec 10% de SVF (v/v) et 1% d’antibiotiques pénicilline/streptomycine (v/v). Les cellules HGF ont été isolées à partir de gencives de patients après consentement et en accord avec le comité éthique de régulation de la faculté de chirurgie dentaire de Strasbourg.

2.2.2. Ensemencement des cellules sur les films de gélatine

Pour toutes les expériences cellulaires, un seul protocole d'ensemencement des cellules est utilisé. Les films de gélatine sont d’abord réticulés dans des boîtes de 24 puits (ou incubés avec des particules avant la réticulation pour certaines expériences) sous le PSM (poste sécurité microbiologique) pour travailler en condition stérile. Ensuite, en fonction des conditions testées, le sérum (SVF ou « Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix C-39215 ») est incubé sur le film. Cette condition de culture cellulaire sans ajout de sérum dans le milieu de culture est dénommée « Starvation Medium + serum released » lorsque le film de gélatine est préalablement chargé en supplément. Si le sérum est ajouté dans le milieu de culture ce qui correspond aux conditions normales de culture cellulaire avec un film de gélatine non chargé, la condition est dénommée « Normal Medium » . Enfin si le sérum n’est pas ajouté dans le milieu de culture et que les films de gélatine ne sont pas chargés, on dénomme la condition « Starvation Medium ». Tous les films sont ensuite stérilisés 15 minutes sous rayonnement UV (tableau 15).

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Tableau 15. Différentes conditions pour la culture cellulaire.

Les cellules sont cultivées dans des boîtes de 75 cm³ jusqu’à confluence. Ensuite elles sont détachées par trypsinisation (TrypLE Express, Gibco) en ajoutant 4 mL de trypsine et en mettant les cellules 5 minutes à 37°C. Pour stopper l’action de la trypsine, 6 mL de milieu de culture sont ajoutés et les cellules sont centrifugées (5 minutes, 1200 rpm). Après la centrifugation, les cellules sont reconcentrées dans 1 mL de milieu de culture, elles sont comptées à l’aide d’une cellule de Neubauer et elles sont ensemencées à une concentration de 5×10⁴ cellules par film (soit 4.42x10⁴ cellules/cm²). Les films sont mis 15 minutes à l’étuve (37°C, 5% CO2) pour permettre l’adhésion; pour terminer, 500 mL de milieu de culture (avec) ou sans supplément en fonction des conditions testées) sont ajoutés dans chaque puits de culture. L’expérience se déroule pendant 3 jours sans renouveler le milieu de culture.

Dans le cas des expériences avec les cellules HGF, les cellules sont cultivées sur les films de différentes rigidités (en fonction du nombre de nanoparticules incubées sur le film) pendant seulement 24 heures. Ensuite des marquages du cytosquelette sont effectués et l’aire des cellules est mesurée en fonction de la rigidité du substrat.

Nom de la condition expérimentale Abréviation Milieu de culture sans sérum Milieu de culture avec sérum Film de gélatine non chargé en sérum Film de gélatine chargé en sérum Normal medium NM X X Starvation Medium + serum released SM + serum released ^{X X} Starvation medium ^{SM X X}

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2.2.3. Activité métabolique des cellules

Pour tester l’activité métabolique des cellules, nous avons utilisé un kit à base de résazurine «In vitro Toxicology Assay Kit, Resazurin based test » (Sigma-Aldrich). La résazurine est un composé initialement non fluorescent qui va être réduit par l’activité métabolique mitochondriale des cellules en résorufine, un composé rouge et fluorescent (figure 57). Ce test réalisé sur des cellules vivantes présente l’avantage de ne pas être destructif pour les cellules, les échantillons peuvent alors être conservés et réutilisés pour des temps de culture plus longs.

Figure 57. Principe de fonctionnement du test résazurine basé sur une réaction d’oxydo-réduction.

Dans le cadre de nos travaux, ces tests ont été réalisés après le jour 1 et le jour 3 de culture cellulaire. Pour cela une solution de résazurine à 10% (v/v) dans du milieu de culture a été préparée et 500 µL de cette solution ont été déposés dans chaque puits. La plaque de 24 puits a été mise pendant 2 heures à l’étuve et la fluorescence a été relevée à l’aide d’un spectrofluorimètre (λex/λem =560/590nm).

2.2.4. Viabilité cellulaire

Pour étudier la viabilité cellulaire durant nos expériences, nous avons utilisé un kit permettant de quantifier simultanément l’apoptose, la nécrose et les cellules vivantes «Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit » (Promokine). En effet, il existe deux types de mort cellulaire différents. La nécrose apparaît généralement après une lésion cellulaire d’origine chimique ou physique et résulte d’un processus dégénératif. L’apoptose, quant à

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elle, est une mort cellulaire programmée qui est dépendante de l’expression de gènes spécifiques conduisant à l’autodestruction cellulaire. On peut la définir comme un « suicide cellulaire » génétiquement programmée. La migration de certains phospholipides comme la phosphatidylserine (PS) de l’intérieur de la membrane cytoplasmique vers l’extérieur est caractéristique de l’apoptose. Ce kit utilise l’annexine V marquée avec de la FITC (fluorescence verte), qui se lie spécifiquement à la PS pour identifier les cellules apoptotiques. Le même kit utilise également l’éthidium homodimère III qui marque les cellules nécrotiques en rouge. Enfin la solution Hoechst 33 358 également intégrée dans le kit est utilisée pour marquer le noyau de toutes les cellules (fluorescence bleue).

Ce test est réalisé après 3 jours d’expérience juste après le test résazurine. Le film est rincé deux fois avec du PBS pour éliminer les traces de résazurine. Ensuite la solution de marquage est préparée en mélangeant 5 µL de chaque marqueur dans 100 µL de solution tampon fournie dans le kit. 50 µL de la solution de marquage sont déposés sur chaque film qui est rincé deux fois avec du PBS après 15 minutes à température ambiante. Les cellules sont ensuite observées après fixation avec le PFA (paraformaldéhyde) avec un microscope à épi-fluorescence (Nikon TE200) équipé de filtres appropriés pour observer les épi-fluorescences verte, rouge et bleue.

2.2.5. Fixation / perméabilisation

Avant d’effectuer des marquages immuno-fluorescents, les cellules sont rincés deux fois avec du PBS et elles sont fixées dans du PFA (Sigma-Aldrich). La solution de PFA (300 µL) à 3.7% (v/v) est incubée sur chaque film avec les cellules pendant 15 minutes à température ambiante. Après deux lavages au PBS, les cellules fixées sont perméabilisées avec une solution à 0.1% (v/v) de triton X-100 (t-octylphenoxy polyethoxyethanol, Sigma-Aldrich) dans le PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Pour finir, les cellules sont incubées pendant une nuit à 4°C avec une solution de SVF (10% v/v).

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2.2.6. Marquages fluorescents

2.2.6.1. Marquages fluorescents des HUVECs 2.2.6.1.1. PECAM-1

PECAM-1 (platelet/endothelial cell adhesion molecule) est une glycoprotéine exprimée sur la surface des cellules et responsable de l’adhésion ces cellules. Nous avons utilisé des anticorps de cette protéine marqués avec un fluorophore pour visualiser les contacts entre les différentes cellules. Ainsi, 90 µL d’anticorps primaire PECAM-1 (PECAM-1 goat antibody, 200 µg.mL^-1, Santa Cruz) à une dilution de 1/50 dans du PBS ont été incubés pendant 90 minutes sur chaque échantillon et deux rinçages avec du PBS ont été réalisés. Ensuite 300 µL d’anticorps secondaire (goat anti donkey FITC, 400 µg.mL^-1, Santa Cruz) à une dilution de 1/100 dans du PBS ont été incubés pendant 30 minutes. Après cette étape, les contacts entre les cellules sont visualisés grâce à la fluorescence émise par la FITC.

2.2.6.1.2. Marquage du cytosquelette (rhodamine-phalloïdine)

Après le marquage PECAM, un marqueur est utilisé pour visualiser le cytosquelette des cellules : la phalloïdine. En effet, la phalloïdine possède une forte affinité pour les filaments d’actine, situés dans le cytosquelette, et donc en couplant cette molécule avec de la rhodamine on peut observer ces filaments au microscope à épi-fluorescence (fluorescence rouge). Après deux rinçages avec du PBS, 300 µL de solution de rhodamine-phalloïdine (0.5 mg.mL^-1, Sigma-Aldrich) à une dilution de 1/100 dans du PBS ont été incubés pendant 15 minutes sur chaque film.

2.2.6.1.3. Marquage du noyau

Le marquage du noyau ou plus précisément de la chromatine est réalisé à l’aide d’une solution colorée Hoechst 33 358 (fluorescence bleue) qui rentre dans la cellule (fixée ou non), par libre diffusion. 300 µL de solution Hoechst 33 358 (1 mg.mL^-1, Sigma-Aldrich) à une dilution de 1/50 dans du PBS ont été incubés pendant 5 minutes sur chaque film.

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L’ensemble de ces marquages est observé avec le microscope à épi-fluorescence (Nikon TE200) équipé avec les filtres appropriés pour observer les fluorescences verte, rouge et bleue. Jusqu’à l’observation, les échantillons sont maintenus à 4°C dans du PBS.

2.2.6.2. Marquages fluorescents des fibroblastes

Pour marquer les cellules 3T3 et les cellules HGF, les mêmes marquages fluorescents ont été réalisés à l’exception du PECAM-1 qui n'a pas été utilisé.

2.2.6.3. Marquages fluorescents des Ptk2

Pour marquer les cellules Ptk2, tous les marquages sont les mêmes à l’exception du PECAM qui est remplacé par le marquage à la vinculine. La vinculine est un marqueur des contacts focaux et permet d’observer le cytosquelette et les points d'ancrage de la cellule sur la surface. Ce marquage permet d’obtenir des informations sur la morphologie et le comportement des cellules.

Pour réaliser ce marquage, 90 µL d’anticorps primaire vinculine (vinculin mouse antibody, 1mg.mL-¹, Sigma-Aldrich) à une dilution de 1/100 dans le PBS ont été incubés pendant 90 minutes. Après deux rinçages avec du PBS, 300 µL d’anticorps secondaire (Alexa Fluor 488 goat anti mouse, 2 mg.mL^-1, Invitrogen) à une dilution de 1/500 dans du PBS ont été incubés pendant 35 minutes. Après cette étape, les contacts focaux sont marqués en vert (Alexa Fluor 488).

2.2.7. Activité antimicrobienne

Pour tester l’activité antimicrobienne des films de gélatine contenant soit la catestatine soit le mélange pénicilline/streptomycine, nous avons utilisé la souche bactérienne S. aureus (ATCC 25923). Les activités antimicrobiennes ont été testées aux jours 1 et 2 après mise en contact avec les bactéries. À cette fin, les souches bactériennes ont été précultivées de manière aérobie à 37°C dans du milieu MBH (Mueller Hinton Broth, Merck, Allemagne) à

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pH 7.3. Ensuite une colonie a été transférée dans 10 mL de milieu MBH à 37°C jusqu’à l’obtention d’une densité de 10⁶ bactéries.mL^-1. Enfin 250 µL de solution pathogène ont été incubés sur les différents films de gélatine à 37°C et la mesure de la croissance bactérienne a été réalisée par lecture de la densité optique à 620 nm après 1 et 2 jours d’expérience. Les contrôles positifs ont été réalisés avec une solution contenant de la tétracycline (10 µg.mL^-1) et de la céfotaxime (0.1µg.mL^-1).

2.2.8. Quantification de la dégradation des films de gélatine

Pour évaluer la dégradation des films de gélatine, nous avons utilisé un kit « Sirius Red/Fast Green Collagen Staining Kit » (Chondrex) permettant de déterminer la quantité de collagène d’un échantillon. En effet, comme la gélatine est du collagène dénaturé, ce kit peut également s’appliquer pour quantifier la masse de gélatine présente dans l’échantillon. Ce kit est composé de deux pigments, un pigment qui se lie spécifiquement au collagène (Sirius Red) et un autre qui se lie aux protéines autres que le collagène (Fast Green). Sirius Red et Fast Green absorbent respectivement à 540 et 605 nm. La masse de gélatine se déduit des mesures d'absorbance par la relation suivante :

Masse de gélatine (µg) = (OD540 - OD605 × 0.291)/0.0378 (1)

Avant de réaliser ce test, les films de gélatine réticulés et non réticulés ont été placés pendant 3 jours dans 2 mL de PBS à 37°C. Ensuite, 0.2 mL de la solution colorée (dye solution) est incubé sur chaque film pendant 30 minutes. Puis la solution est retirée et le film est rincé abondamment avec de l’eau distillée. Pour terminer 1 mL de solution tampon d’extraction est ajouté (solution basique) pour dissoudre le film et l’absorbance de la solution est lue à 540 et 605nm à l’aide d’un spectrofluorimètre.

Les résultats obtenus sont comparés à ceux obtenus pour un film de gélatine non dégradé (film non incubé dans PBS) et permettent le calcul du pourcentage de dégradation.

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