4. Analyses physico-chimiques
4.3. Analyses élémentaires
4.3.1. Microscopie électronique à balayage et microanalyse élémentaire
Les observations morphologiques de la surface du cheveu, combinées à la micro-analyse élémentaire ont été réalisée par SEM-EDS.
Les observations ont été réalisées à l’aide de deux appareils : un SEM XL30 CP de chez FEI et un SEM 7800F de chez JEOL, équipé d’un canon à effet de champ (FEG – Field Effect Gun) permettant l’obtention d’images à plus haute résolution. Ces appareils sont équipés de détecteurs à dérive au silicium (SDD – Silicon Drift Detector) pour la microanalyse élémentaire par rayons X. L’appareil XL30 CP dispose d’un détecteur SDD X-MAX 50 (Oxford Instruments), équipé d’une fenêtre de béryllium et d’une surface active de 50 mm². Le FEG-SEM 7800F dispose quant à lui de deux détecteurs SDD AXS 6| 30 (Bruker), équipés d’une fenêtre de Be et d’une surface active de 30 mm². Les observations morphologiques ont été réalisées en mode « électrons secondaires » (SE – Secundary Electrons) avec
une tension d’accélération de 5 keV et une distance de travail d'environ 4 mm. Le mode « électrons rétrodiffusés » (BSE – Back Scattered Electrons) a été utilisé pour les analyses élémentaires grâce à une tension d’accélération de 15 ou 20 keV et une distance de travail de l'ordre de 10 mm. Dans ces conditions, la profondeur d’analyse est d’environ 1 µm, la microanalyse est donc limitée, dans notre cas, à l’analyse de la surface (diamètre minimum d’un cheveu de l’ordre de 50 μm).
Les images et spectres EDS obtenus sont finalement traités à l’aide des plateformes analytiques AZtec
Energy Advanced pour les analyses sur le SEM XL30 CP, et Bruker Quantax Duo 400, logiciel Esprit,
pour les analyses sur le FEG-SEM 7800F.
4.3.2. Spectroscopie de fluorescence des rayons X et imagerie par faisceau d’ions
Les analyses élémentaires globales du cheveu ont été réalisées par deux techniques : la spectroscopie XRF et l’imagerie PIXE.
₪ Paramètres d’analyse en XRF
L’appareil du C2RMF est équipé d’un tube à rayons X Moxtek à anode de Mo (raies d’énergie Kα à 17,5 keV et Kβ à 19,6 keV), alimenté par une tension de 40 kV et une intensité de 800 μA. Un absorbeur de Co de 50 μm d’épaisseur a été placé à la sortie du tube, afin de réduire le bruit de fond dans la zone d’intérêt (entre 7,5 et 15 keV). L’échantillon est placé à une distance d’environ 1 cm du tube à rayons X, l’angle d’impact est de 45° et l’angle de détection de 90°. La profondeur d’analyse dans ces conditions expérimentales est d’environ 50-100 µm, ce qui correspond au diamètre moyen d’un cheveu. La détection a été effectuée par un détecteur Si à barrière de surface (XFlash 2000A Röntec) doté d’une fenêtre d’entrée en Be de 8 μm d’épaisseur. Les spectres sont collectés par un analyseur multicanal (Amtek MCA8000A portable) pendant une durée d’enregistrement de 1200 secondes et traités par le logiciel PyMCA (version 4.3.0).a
₪ Paramètres d’analyse en PIXE
Les analyses PIXE s’inscrivent dans le cadre du projet PIXHAM (PIXE imaging of Hair from Andean
Mummies), dont la proposition a été déposée et acceptée au cours de ces travaux.
aLes spectres XRF ont été effectués avec deux détecteurs différents. Le détecteur le plus récent, plus
performant, permet de détecter des éléments plus légers que l’argon, tels que le soufre et le chlore par exemple. L’absence de ces composés de certains spectres ne constitue donc pas une indication de son absence dans les cheveux analysés puisqu’elle peut être due au détecteur et non pas à l’échantillon, notamment dans le cas du soufre, élément majeur du cheveu.
126
L’accélérateur de particules du C2RMF est dédié aux analyses élémentaires et stratigraphiques, dites non-invasives, des objets du patrimoine historique et culturel. Le système de détection mis en place sur la ligne à faisceau extrait utilise plusieurs détecteurs à surface active, permettant d’augmenter l’angle de détection des rayons X pour obtenir rapidement des cartographies élémentaires à haute résolution256,257.
Les analyses PIXE des échantillons de cheveux sélectionnés ont été réalisées à l’aide de trois détecteurs SDD (surface active de 50 mm², fenêtre d’entrée en Be de 8 µm), dont un était équipé d’un filtre en aluminium de 50 µm d’épaisseur et les deux autres de filtres en Mylara de 100 µm d’épaisseur – les données enregistrées par ces deux derniers détecteurs ont été sommées. L’énergie du flux de protons a été fixée à 3 MeV et son intensité à 2 nA, afin d’obtenir un diamètre de faisceau le plus petit possible, entre 30 et 40 µm. L’acquisition a été réalisée en balayant l’échantillon sur une zone large de 2000 µm et haute de 500 µm, avec une taille de pixels de 10 x 10 µm, pour des temps d’analyse entre 20 et 45 min et dose totale d’irradiation de 500 000 ou 1 000 000.
Les données brutes obtenues sont ensuite traitées via les logiciels spécialement développés à AGLAE :
AGLAE-Map (v. 3.4.2)258 et PLotAndROI (v.3.1.1), permettant la visualisation des spectres PIXE d’un échantillon donné pour un détecteur donné, ainsi que la visualisation des cartographies élémentaires associées à des pics d’intérêt de ce spectre et la superposition de cartes de différents éléments.
₪ Quantification
Les procédures de quantification ont été effectuées par Thomas Calligaro et Quentin Lemasson de l’équipe d’AGLAE+. Les procédures sont reportées succinctement dans ce paragraphe.
N.B. Il est important pour ce paragraphe de noter que les résultats obtenus ici ne sont que semi-quantitatifs et constituent une indication d’un ordre de grandeur, et non pas une concentration précise.
Spectroscopie XRF
Le traitement par le logiciel PyMCA permet d’avoir une première approximation des quantités présentes en éléments détectés. Pour cela, une première approximation est faite, qui consiste à assimiler le cheveu à une feuille de Mylar (matrice constituant les cibles minces des standards). Les différents spectres sont alors normalisés par comparaison des massifs des raies du Mo et des raies de l’effet Compton obtenus pour les échantillons, avec ceux des cibles standards d’éléments d’intérêt de concentrations connues. Après normalisation, il est alors possible de retrouver le pourcentage
a Mylar : poly(téréphtalate d'éthylène), PET, de formule brute (C10H8O4)n
127
massique d’un élément donné à partir des données obtenues pour la cible standard correspondante, puis d’estimer les quantités en ppm des éléments présents.
Imagerie PIXE258
Afin de pouvoir effectuer des calculs de quantification, trois cibles minces contenant une quantité connue d’un élément d’intérêt ont été analysées chaque jour : GaAs, CuS et Fe.
Dans un premier temps, l’angle solide a été normalisé pour une charge de 1 µC et les filtres ajustés jusqu’à ce que les spectres des standards soient acceptables. Une fois ces paramètres fixés, ils ont été entrés dans le logiciel GUPIX/TRAUPIXE pour les calculs de quantification. Les résultats de ces calculs ont finalement été normalisés par rapport à la dose totale reçue par les échantillons pour chaque analyse et par la surface occupée par l’échantillon sur la zone analysée.
Ces calculs nous donnent donc les quantités de chaque élément détecté dans l’échantillon en ng/cm².
Chapitre C
-Approche protéomique pour
l’étude de la conservation de
cheveux de momies
préhispaniques de la côte andine
cheveux de momies préhispaniques de la côte andine
L
es cheveux de momies sont étudiés depuis des décennies par diverses techniques physico-chimiques, visant à les caractériser au niveau structurel et élémentaire. Cependant, peu de travaux se sont intéressés à leur caractérisation moléculaire et à l’étude de leur état de préservation au niveau moléculaire. Pouvoir estimer cet état de conservation pourrait notamment permettre d’adapter la stratégie analytique qui sera appliquée aux échantillons de cheveux archéologiques, de s’assurer de la fiabilité des résultats d’analyse obtenus et également offrir un modèle idéal, afin d’étudier les processus de dégradation des cheveux modernes et l’influence de l’environnement sur leur conservation. Ainsi, de telles études pourraient aider à la mise en place de protocoles de conservation des cheveux de momies, grâce à une meilleure compréhension de la structure capillaire et des interactions avec son environnement.L’objectif de cette partie des travaux de recherche était donc de mettre en place une approche interdisciplinaire, basée sur l’observation globale et structurelle des fibres capillaires archéologiques et sur leur caractérisation élémentaire et moléculaire. Il s’agissait notamment d’implémenter une stratégie protéomique bottom-up pour l’étude des cheveux de momies, afin de s’assurer que les protéines capillaires sont toujours identifiables dans les fibres anciennes, et dans ce cas, d’aller plus loin dans leur caractérisation en s’attachant à l’étude des PTMs, des processus de dégradation et si possible, des interactions métaux-protéines – interactions arsenic-kératine plus particulièrement. Pour cela, des échantillons de cheveux modernes ont été utilisés comme référence, dans deux objectifs : d’une part, mettre en place notre approche protéomique sur des échantillons non précieux, avant de l’appliquer aux cheveux archéologiques, et d’autre part servir de référence pour l’interprétation des résultats des analyses moléculaires, mais aussi structurelles et élémentaires.
Ce chapitre se divise en 4 parties :
1. La description des échantillons archéologiques étudiés et des résultats d’analyses préliminaires obtenus par observation au microscope électronique à balayage (SEM,
Scanning Electron Microscopy) et spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR).
2. Le choix et la mise en place du protocole final pour l’étude protéomique par nanoLC-ESI-MS/MS des cheveux de momies du corpus ayant fait l’objet d’une publication acceptée dans le journal Analytical and Bioanalytical Chemistry.
3. L’étude de l’état de préservation des cheveux de momies du corpus par l’approche protéomique mise en place.
4. La détection des métaux dans les cheveux par microanalyse élémentaire couplée au SEM (SEM-EDS), par spectroscopie de fluorescence X (XRF) et par spectroscopie d’émission de rayons X induite par faisceau d’ions (PIXE).
cheveux de momies préhispaniques de la côte andine