Analyse de la viabilité

En complément de l’identification des populations microbiennes, des analyses de la viabilité cellulaire des microorganismes qui composent les biofilms ont été réalisées sur les électrodes secondaires avec l’aide très précieuse de Simon Guette-marquet. L’objectif est encore une fois d’apporter des éléments de réflexion pour avancer sur les hypothèses émises à propos du découplage courant/colonisation.

Initialement, il était prévu d’évaluer la viabilité des cellules microbiennes sur des lots d’électrodes polarisées pendant 4 et 30 jours. Cependant, les analyses réalisées sur les électrodes de 30 jours ont toutes échoué, en raison de l’utilisation d’un filtre non adapté pour l’observation du fluorochrome SYTO9. Contraint par le temps, seule l’analyse de la viabilité cellulaire sur les électrodes de 4 jours a pu être effectuée avec le bon filtre. Des dupliquas d’électrodes simples, d’électrodes situées dans les dispositifs « canal » de 1 mm et de 5mm ont été analysés.

175 Des images ont été acquises au microscope à épifluorescence pour 6 zones différentes le long des électrodes (Figure 14).

Figure 14 : Schéma représentant l a localisation des zones d’acquisition lors de l’analyse de

viabilité cellulaire.

Pour chaque zone 4 spots différents sont caractérisés par microscopie à épifluorescence, ce qui représente alors un total de 24 stacks d’images par électrode. Un exemple de ces ensembles de 24 images est illustré dans la Figure 18 pour un lot complet d’électrodes secondaires composé d’une électrode simple (A), d’une électrode située dans un canal de 5 mm (B) et d’une électrode dans un canal de 1 mm (C).

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A

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Figure 15 : Images prises au microscope à épifluorescence (Kit Live/dead Baclight) de 3

électrodes secondaires en tissu de carbone polarisé es à -0.2V/ECS pendant 4 jours : A) Electrode simple B) Electrode située dans un canal de 5 mm de hauteur et C) Electrode située dans un canal de 1 mm de hauteur. Les électrodes ont été marquées au Syto9 (vert) et à l’Iodure de propidium (orange).

Le traitement post-acquisition des stacks d’images (section 3.3 du chapitre 2) permet d’extraite deux paramètres quantitatifs :

- ӨSYTO9 : le taux de recouvrement de la totalité des cellules vivantes et mortes ou altérées - ӨIP : le taux de recouvrement des cellules mortes ou dont la membrane est altérée

Le taux de viabilité cellulaire est alors défini comme :

𝜃_{𝑆𝑌𝑇𝑂9}− 𝜃_𝐼𝑃

𝜃𝑆𝑌𝑇𝑂9 ∗ 100

Pour chaque zone le long de l’électrode, le taux moyen de viabilité des cellules a été déterminé sur une base de 8 spots différents (4 spots par dupliqua d’électrodes). Les résultats sont présentés sous forme d’histogrammes sur la Figure 16.

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Figure 16 : Taux de viabilité des cellules microbiennes le long de différents types

d’électrodes secondaires (électrodes simples et électrodes situées dans des canaux de 1 et 5 mm de hauteur). Pour chaque zone le long des électrodes le taux de viabilité est estimé sur la base de 8 spots différents.

Dans l’ensemble, la viabilité des bactéries au bout de 4 jours reste inférieure à 60 %. Afin d’avoir une base de comparaison, des exemples d’études portant sur la viabilité d’un biofilm électroactif ont été recherchés dans la bibliographie et deux études ont retenu notre attention. Chae et al., ont estimé la viabilité d’une bioanode utilisée dans une PACM inoculée avec une culture mixte (boues activées) et alimentée avec de l’acétate à 69 % après 100 jours d’expérience (Chae et al., 2009). Read et al. ont trouvé que la viabilité d’une bioanode utilisée dans une PACM inoculée avec une culture pure de P.aeruginosa et alimentée avec de l’acétate variait entre 44 et 76 % en fonction de l’épaisseur du biofilm après seulement 3 jours (Read et al., 2010). Bien que les conditions opératoires soient différentes dans chacune des études, il semble néanmoins qu’une viabilité de 60 % après 4 jours d’expérience soit cohérente avec les résultats de la bibliographie.

0 20 40 60 80 100 0 1 4 6 9 10 T aux de vi abi li té ( %) Longueur (cm) ES 0 20 40 60 80 100 0 1 4 6 9 10 Taux de v iabi li té ( %) Profondeur du canal (cm) 1 mm 0 20 40 60 80 100 0 1 4 6 9 10 T aux de vi abi li té ( %) Profondeur du canal (cm) 5 mm

179 Pour affiner la comparaison des résultats, les taux moyens de viabilité et les écart-types ont été estimés chacun sur une base de 12 mesures (6 mesures par répliqua d’électrodes). A partir de ces deux paramètres, les taux inférieurs (taux moyen – écart-type) et supérieurs (taux moyen + écart- type) ont ensuite été déterminés (Tableau 6).

Tableau 6 : Taux moyens de viabilité, écart -types, taux inférieurs et supérieu rs déterminés

pour les différents types d’électrodes secondaires : électrodes simples et électrodes canaux de 1 et 5 mm.

Electrodes secondaires

Taux moyen de

viabilité (n=12) Ecart-type (n=12) Taux inférieur Taux supérieur Electrodes

simples 37.2 10.6 26.6 47.8

Canaux 1 mm 40.8 13.9 26.9 54.7

Canaux 5 mm 54.2 5.9 48.3 60.1

L’analyse des populations microbiennes indique qu’en majorité l’espèce G. sulfurreducens colonise les électrodes secondaires. Cette espèce est classifiée comme étant anaérobie stricte (Caccavo et al., 1994). Or, nos expérimentations ne sont pas réalisées en condition stricte d’anaérobiose. Seul un bullage d’azote d’une durée de 30 minutes est effectué en début d’expérience pour chasser l’oxygène initialement présent dans le milieu de culture synthétique. De plus, lors du retrait des électrodes (simples et canaux) du réacteur en fin d’expérience, celles-ci sont transitoirement exposées à l’oxygène de l’air ambiant avant d’être transféré dans une boîte à gant gonflable anaérobie. Lors de cette manœuvre, les électrodes placées dans les dispositifs « canaux » sont en quelques sortes protégées de l’oxygène tandis que les électrodes simples y sont directement exposées. Ceci pourrait alors expliquer pourquoi la viabilité des électrodes simples semble être légèrement plus faible par rapport à celle des électrodes « canaux » d’une part, et pourquoi le profil de viabilité des électrodes simples est assez disparate d’autre part. En effet, le haut de l’électrode (0 à 1 cm) présente des taux de viabilité supérieur à 40 % contrairement au reste de l’électrode (4 à 10 cm) qui est positionnée plus en profondeur dans le réacteur.

Par la suite il ne serait donc pas légitime de comparer la viabilité des électrodes simples avec celle des électrodes « canaux » car ces deux types d’électrodes n’ont pas été exposés de la même manière à l’oxygène lors de leur extraction du réacteur. Seuls les résultats des électrodes « canaux » de 1 et 5 mm ont alors été comparés entre eux. Il s’avère que la viabilité la plus élevée est obtenue au sein des canaux de 5 mm avec en moyenne 54.2 ± 5.9 % contre 40.8 ± 13.9 % pour les 1 mm. Le profil de viabilité des canaux de 1 mm est également hétérogène : les extrémités des canaux ont un taux de

180 mortalité plus élevé que le centre. En comparaison, les canaux de 5 mm affichent un profil de viabilité plus homogène le long des canaux. Nous savons que dans les canaux des limitations importantes de transport de matière ont lieu.

Une première hypothèse aux résultats obtenus serait alors l’existence d’une acidification au sein des canaux qui serait alors plus prononcée dans les 1 mm que dans les 5 mm et permettrait de justifier les résultats obtenus.

Une deuxième hypothèse serait qu’au cours des 4 jours d’expérience, de l’oxygène (présent dans l’air) se serait introduit dans les réacteurs car les réacteurs ne sont pas totalement étanches et aurait progressivement diffusé dans le milieu synthétique car l’anaérobiose n’est pas contrôlée. La diffusion de l’oxygène en milieu aqueux est un phénomène lent. Il est théoriquement admis que dans un tel scénario un gradient (important) d’oxygène se crée ainsi entre la partie haute et la partie basse du réacteur, surtout si des espèces microbiennes aérobies facultatives en profitent pour consommer l’oxygène soluble. Une hauteur de canal de 5 mm permettrait alors une diffusion homogène de l’oxygène dans tout le canal (si la consommation est négligeable), ce qui se traduit par l’obtention d’un profil de viabilité homogène et un écart-type faible. A l’inverse, une hauteur de 1 mm rendrait la pénétration de l’oxygène plus difficile au sein du canal, les extrémités seraient alors les premiers à être exposés à l’oxygène tandis que les bactéries anaérobie stricte seraient plus protégées au centre. Cette hypothèse permettrait d’expliquer les résultats obtenus.

Il est fort dommage (et frustrant) de ne pas pouvoir comparer ces résultats à la viabilité dans les biofilms de 31 jours.