Analyse transcriptomique globale

Cette analyse a été réalisée sur les équipements de la plateforme Génomique Environnementale et humaine de Biogenouest.

Des macrophages M0 infectés ou non puis traités par le Galf-oct ou par NH2-Galf pendant 24h à une concentration de 80 µM ont été analysés par transcriptomique globale sur puces à ARN Agilent® (SurePrint G3 MicroarrayKit 8x60K V2 Agilent® Technologies). Ces puces transcriptomiques comportent environ 26 000 ARN messagers (ARNm) sur lesquels vont

s’h ide les ARN de os ha tillo s pe etta t de connaitre le i eau d’e p essio des

ARNm d’u g a d o e de g es. Le p i ipe de ette te h ologie est de fi e su u e

la e de e e u pa el d’ARNs qui vont servir de sonde pour hybrider les ARNm des échantillons à analyser (Figure 36). Après extraction des ARN totaux des échantillons à

a al se , u e p e i e tape de p pa atio pe et d’o te i des ARN anti sens marqués avec un fluorochrome (dans notre cas la Cyanine-3, (Cy-3)). Ces ARN marqués vont

s’h ide a e les so des fi es su la la e de e e. Ap s l’h idatio les la es so t s a es, la fluo es e e ise au i eau de ha ue so de est d’auta t plus i te se ue l’ARN o espo da t est fortement exprimé da s l’ ha tillo tudi . Ainsi on obtient une

i age de l’e p essio globale des ARN messagers da s l’ ha tillo tudi . L’a al se de

ces données et la comparaison des échantillons entre eux permet de mettre en évidence des variations transcriptomiques entre les conditions étudiées. Une autre façon de

o pa e ha tillo s est de a ue a e fluo o h o es diff e ts les pools d’ARN sou e t C a i e et C a i e et d’a al se le i eau d’e p essio des ha tillo s l’u pa appo t à l’aut e e les d posa t su la e pu e et e s a nant la lame pour les 2 fluorochromes. On obtient alors 2 i ages ue l’o peut supe pose pour comparer les 2 échantillons. Dans ce travail, nous avons comparé 2 conditions traitées à une condition

o t ôle et ous ’a o s do pas fait l’a al se de ette façon. Les puces Agilent® portent en plus des ARNm, des ARN non codants ui ’o t pas t a al s s lors de ce travail, ainsi

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Figure 36 : Représentation schématique de l'analyse transcriptomique globale à l'aide de la technologie Agilent®

Au total, 6 conditions ont été réalisées : macrophages M0 non infectés non traités ou traités par Galf-oct ou par NH2-Galf, et macrophages M0 infectés par L. donovani non traités ou traités par Galf-oct ou par NH2-Galf.

Pour la condition contrôle non infectée et la condition non infectée traitée par Galf-oct, les données représentent la moyenne de 5 échantillons analysés au cours de 2 expériences indépendantes, pour les autres conditions les données sont issues de 4 échantillons analysés au cours de 2 expériences indépendantes. Pour toutes les conditions, les macrophages étaient issus de 3 donneurs différents.

Les ARN ont été extraits avec le kit RNeasy® Mini-kit (Qiagen), a e ajout d’u e tape de

digestio de l’ADN a e le kit RNase-Free DNase set Qiagen®. Brièvement, les cellules ont été lysées par le tampon de lyse additionné de β-mercaptoéthanol, puis les lysats ont été

récupérés et ho og is s olu e à olu e da s l’ tha ol à %, a a t d’ t e d pos s

Schéma Sorya Belaz IRSET, Rennes

Les suc res d e sy n thèse c o m m e im m u n o m o d u lat eurs

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su les olo es. Ap s u p e ie la age pe etta t d’ li i e les sels a a t pu se fi e

sur la colonne, l’ADN a t li i par le traitement à la DNase. Puis 3 lavages supplémentaires ont été alis s a a t d’ lue les ARN da s µl d’eau « RNase-Free » fournie dans le kit.

Ap s dosage de la ua tit d’ARN par spectrométrie (NanoDrop^TM 2000 Thermo Fisher Scientific) et vérification de la qualité des éluat (Bio Analyzer 2100 Agilent®), les ARN sont ensuite p pa s e ue de l’h idatio (Figure 37). La p e i e tape est l’ajout d’u

promoteur T7 à la queue poly A des ARNm, puis une étape de rétro transcription permet

d’o te i les ADNc anti sens et les ADN se s. Ces de ie s se e t de at i e à l’ARN

polymérase pour synthétiser les ARN complémentaires (ARNc) en présence de désoxycytidine triphosphate (dCTP) marquée par la Cy-3, les i s d’ARN anti sens marqués par Cy-3 sont ainsi obtenus, et les échantillons sont purifiés sur colonne (RNeasy Mini kit Qiagen® pou li i e les i s d’ADN esta ts (Figure 37).

Figure 37 : Etapes de préparation des ARNc marqués en vue de l'hybridation

Schéma Sorya Belaz IRSET, Rennes

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Les ARNc marqués so t e suite d pos s su les la es et l’h idatio su les ARN i les est réalisée sous rotation constante et chauffage à 65°C pendant 17 heures. Après lavages, les lames ont été lues à l’aide du scanner Agilent® SureScan Microarray et les données brutes

de i eau d’e p essio de ha ue ARN fi su les pu es sont récupérées par Agilent® Feature Extraction Software.

A l’aide du logi iel R, les i eau d’e p essio de ha ue g e o t t o alis s pou

chacune des 2 expériences, puis avec le logiciel Excel les o e es d’e p essio de ha ue

gène étudié pendant les 2 expériences ont été calculées, pour chaque condition. Puis les

i eau d’e p essio de chaque gène ont été comparés au groupe « contrôle non traité » correspondant (non infecté ou infecté), pour chaque traitement (Galf-oct ou NH2-Galf) permettant ainsi d’o te i pou ha ue g e tudi et pou ha ue condition un Fold Change (FC d’e p essio comparée à son contrôle.

La liste des gènes associés au FC correspondant pour chaque condition a été étudiée à

l’aide du logi iel Tig Me 4 (260), permettant de rechercher des clusters de gènes surexprimés ou sous-exprimés après traitement par Galf-oct ou NH2-Galf. La liste des gènes de chaque cluster a ensuite été analysée sur STRING DataBase (261) pour rechercher des interactions connues ou prédites (base de données GO = gene ontology ou KEGG = Kyoto encyclopaedia for genes and genomes) entre les protéines codées par ces gènes, permettant de mettre en évidence les réseaux protéiques affectés par le traitement par les dérivés du Galf.