Analyse statistique

Hybridation 60 1 minute Dénaturation 95 15 secondes 1 Hybridation 60 15 secondes Dénaturation 95 15 secondes

La fluorescence est mesurée de manière ponctuelle à la fin de l’étape d’élongation de chaque cycle d’amplification. Elle permet ainsi d’établir une courbe de quantification représentant la fluorescence en fonction du nombre de cycles. Afin de s’assurer de la spécificité des produits de PCR amplifiés, une courbe de fusion est réalisée après la phase d’amplification.

Elle consiste en une étape de dénaturation ponctuelle à 95°C puis une hybridation à 65°C pendant 60 secondes et enfin une étape de fusion avec élévation progressive de la température jusqu’à 95°C par incrément de 0,1°C par seconde. La fluorescence est lue en continu pendant cette dernière phase de fusion. L’établissement de la courbe de fusion (fluorescence en fonction de la température) permet de discriminer les dimères d’amorces et les produits de PCR spécifiques. Pour s’assurer de la réussite de la technique, la valeur de l’inclinaison de la pente, «

slope ^» en Anglais, doit être comprise entre -3,2 et -3,5 (annexe XIII).

4- Analyse statistique :

4-1- Etude cas-témoins (polymorphismes (CAG)n de la POLG1, A1298C de la MTHFR et T3801C du CYP1A1) :

Nous avons procédé à une étude transversale de type cas-témoins pour chercher à déceler une différence de distribution de quelques variants génétiques entre une population de cas (hommes infertiles), constituée d'individus diagnostiqués avec le trouble d'intérêt, et une population de témoins (supposés sains) sélectionnés dans la population générale et qui ne sont a priori pas porteurs du dysfonctionnement étudié.

L’objectif de cette étude était de vérifier, sur un «

échantillon représentatif ^» de la population algérienne, des données publiées dans la littérature qui associent (ou non) les polymorphismes étudiés à un risque accru de développer une infertilité masculine.

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L’analyse statistique réalisée dans le cadre de notre étude a été principalement basée sur des comparaisons de fréquences des allèles des gènes étudiés entre infertiles et témoins sains, par l’utilisation du test du χ2 (aussi appelé test de Pearson) à partir du logiciel Epi-info®

(version 6.0) ; logiciel de statistiques appliquées à l'épidémiologie disponible en accès et téléchargement gratuit à l’adresse : http://www.epiconcept.fr.

Avant toute analyse statistique, il est réalisé une évaluation de l’équilibre de Hardy-Weinberg (Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE)) pour éviter des erreurs importantes dues à un biais de

génotypage ou de sélection. Pour vérifier que notre population est en équilibre d’Hardy-Weinberg, nous avons utilisé le test du χ2 standard. Cette évaluation classique du χ2

est possible lorsque les effectifs sont supérieurs à 5. Dans le cas contraire, il est nécessaire d’utiliser le χ2 corrigé, soit avec la correction de Yates (effectif inférieur à 5) soit avec la correction de Fisher (effectif inférieur à 3). Cela a été fait en ligne sur le site :

http://analysis.bio-x.cn/SHEsisMain.htm.

Si le degré de significativité (p-value) indiqué est < 0,05, cela permet de conclure que notre population d’étude n’est pas en équilibre d’Hardy-Weinberg. Cette valeur a été déterminée pour les cohortes de témoins et d’infertiles (à la fois pris ensemble ainsi que séparément en sous-groupes AZOs, OATs et ASTs).

Les résultats du génotypage pour les polymorphismes étudiés de tous nos infertiles (sous-groupes AZOs, OATs et ASTs) et témoins recrutés pour cette étude ont été traités par

Excel (Microsoft Office^® 2013) (pour le calcul des fréquences génotypiques et alléliques) et comparés par le logiciel Epi-info^® (version 6.0) (afin d’évaluer la signification de l’association entre le facteur de risque étudié et la susceptibilité à l’infertilité masculine avec le test χ2 et le calcul de l’Odds Ratio (OR)) pour la signification statistique. Pour calculer l’OR nous avons établi un tableau de contingence croisé 2×2 typique :

Tableau 22 : Tableau de contingence croisé.

Patients Contrôles Total Présence du facteur de risque

présumé de la pathologie

a B a + b

Absence du facteur de risque

présumé de la pathologie

c D c + d

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Les OR et les intervalles de confiance (Confidence Interval (CI)) à 95 % ont été calculés en tenant compte de l'allèle à risque de chaque polymorphisme ou des génotypes contenant les allèles à risque (l’allèle ≠10 dans le cas de la POLG1). Ce paramètre statistique est utilisé dans les études de type cas-témoins où il permet l'appréciation de l’intensité d’une association entre un marqueur et une maladie. C’est une estimation du risque relatif dans le cas où il est impossible de mesurer les risques de la maladie chez les sujets exposés et non exposés au facteur étudié. Lors d’une étude d’association de type cas-témoins, seul l’OR peut être utilisé et non pas le risque relatif. L’OR, comme toute estimation réalisée sur un échantillon, doit être présenté avec son CI à 95 %, qui mesure la précision de l'estimation.

L’évaluation du degré de significativité (p-value) des différences de fréquence de chaque allèle entre infertiles et témoins correspond à la probabilité que l’écart global soit imputable seulement

aux fluctuations du hasard. Lorsque la probabilité p est égale ou inférieure à 0,05 (5 %), il y a moins de 5 chances sur 100 que la distribution résulte du hasard. Ainsi la différence de

distribution entre les populations de malades et de témoins pour un marqueur donné, est statistiquement significative et le marqueur génétique étudié, dans ce contexte, peut être

considéré comme étant associé à l’infertilité masculine.

Nous avons analysé 3 effets possibles des allèles mutés (≠10 (CAG)n pour la POLG1) sur notre population d’infertiles (prise dans l’ensemble et pour chaque sous-groupe) en comparaison avec nos témoins.

Tableau 23 : Formulation des différents modèles de comparaison pour l’étude de l’effet de l’allèle ≠10 (infertiles/témoins).

Effet analysé Modèle de comparaison

Effet dominant ≠10/≠10 + ≠10/10 vs 10/10 Effetrécessif 10/10 + ≠10/10 vs ≠10/≠10 Effet hétérozygote 10/10 vs ≠10/10

Cette démarche méthodologique a été appliquée aux deux autres polymorphismes étudiés (T3801C du CYP1A1 et A1298C de la MTHFR).

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4-2- Analyse statistique des résultats de la PCR quantitative :

Il est à noter que la quantification de l’ADNmt leucocytaire par le calcul du rapport ND2/ATPase ainsi que son implication comme étiologie possible de l’infertilité masculine n’a pas été rapportée dans la bibliographie.

Nous avons soumis nos résultats à divers tests statistiques visant à analyser cette distribution et de déterminer si ce paramètre est lié à l’infertilité masculine. Cela a été fait par la comparaison de la distribution des valeurs mesurées sur une population d’hommes infertiles avec celles relevées sur la population de témoins.

Tous les tests statistiques utilisés ont été réalisés sur des macros Excel (Microsoft Office^® 2010) téléchargées sur le site : http://www.anastats.fr/outils.php.

4-2-1- Analyse de la normalité (test de Shapiro-wilk) :

Après calcul des rapports ND2/ATPase dans le but de quantifier l’ADNmt dans les leucocytes pour nos cohortes d’infertiles et de témoins. Nous avons analysé la distribution de ce paramètre pour voir si elle suit une loi normale (loi de Laplace-Gauss), le test de Shapiro-wilk est utilisé. Il s’agit d’un puissant test de normalité qui utilise une technique d'analyse de variance pour détecter l'écart d'un échantillon à la normalité. De manière simple, il recherche à quel point une distribution de fréquences observées correspond à la distribution de fréquences attendues. Le test de Shapiro-Wilk (Shapiro et Wilk, 1965) est sensible à la fois à l'asymétrie et à l'aplatissement.

L'hypothèse nulle du test est que les données sont normalement distribuées, et que par

conséquent si la p-value de W est < 0,05 l'hypothèse de normalité doit être rejetée. On utilise l'algorithme de Royston (Royston, 1982) pour calculer W et sa p-value.

Pour savoir si on doit accepter ou rejeter l'hypothèse nulle, la p-value est comparée au seuil alpha. Si la p-value est > au seuil choisi (0,05), les données sont normalement distribuées et

si la p-value est < au seuil choisi, la conclusion est que la distribution n'est pas normale. La normalité peut également être observée sur les graphiques, si la distribution est normale, les points correspondant aux valeurs mesurées sont alignés sur une ligne droite.

80 4-2-2- Analyse de la conformité (test de Student) :

Lorsqu’on étudie une variable aléatoire quantitative donnée (dans ce contexte c’est le rapport ND2/ATPase) notée X, on mesure ce caractère dans un échantillon d'individus de taille n tiré d'une population. Par ailleurs on a la moyenne théorique de X dans une population de référence (notre cohorte de témoins), notée μ0 et sa variance notée σ2 (écart type noté σ).

La question est de savoir si la moyenne de X, dans l'ensemble de la population d'où est issu notre échantillon, notée μ, est égale à cette moyenne théorique μ0 de la population de référence (hypothèse nulle H0 pour un test bilatéral) ou si les deux moyennes sont statistiquement différentes (hypothèse alternative H1) ; c'est le test de conformité.

Si la p-value est inférieure au seuil choisi (0,05), la moyenne observée est significativement différente de la moyenne théorique.

4-2-3- Analyse de la variance (test de Brown-Forsythe) :

Ce test peut être envisagé, de manière plus informelle, comme une ANOVA (Welch, 1951)

basée sur les écarts absolus des valeurs mesurées à la médiane de chaque groupe. Lorsque les écarts sont plus ou moins les mêmes dans chaque groupe, on considère que les

variances intra-groupes sont homogènes.

4-2-4- Comparaisons multiples (test de Kruskal-Wallis) :

Pour analyser la distribution du paramètre étudié (rapport ND2/ATPase indiquant la quantité de l’ADNmt) pour nos cohortes (infertiles, AZOs, OATs, ASTs et témoins), nous avons utilisé le test de Kruskal-Wallis (Kruskal et Wallis, 1952). C’est un test non paramétrique à utiliser lorsqu’on est en présence de k échantillons indépendants.

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I- Dosage des acides nucléiques :

Dans la perspective de procéder à diverses analyses moléculaires sur les prélèvements d’ADN extraits de notre population d’étude (infertiles et témoins), nous avons mesuré la concentration des ADN et évalué la pureté de l’ADN extrait. Ces paramètres peuvent être cautions de la réussite des techniques de biologie moléculaire réalisées, en particulier celles utilisées pour l’analyse de l’ADNmt.

Par la suite, des dilutions aux ≈ 1/5^ième dans de l’eau distillée ont été effectuées. Les concentrations ainsi que les rapports DO 260/280 et DO 260/230 ont été remesurés de

nouveau sur le Nanodrop^®. De la même manière, les moyennes ainsi que les écarts-types de ces trois paramètres ont été recalculés (tableau 24).

Tableau 24 : Résultat du dosage de l’ADN extrait ainsi que la détermination des rapports 260/280 et 260/230 pour notre population d’étude.

Moy [C] ADN (ng/µl) Moy 260/280 Moy 260/230

Infertiles 472,61 ± 248,98 1,83 ± 0,096 1,99 ± 0,338

Infertiles (dilutions) 103,49 ± 25,723 1,89 ± 0,089 2,01 ± 0,407

Témoins 398,46 ± 261,32 1,82 ± 0,068 2,05 ± 0,305

Témoins (dilutions) 110,11 ± 28,248 1,88 ± 0,093 2,04 ± 0,294

Ces résultats mettent en évidence la qualité de l’ADN extrait. En effet, la moyenne des rapports DO 260/280 et DO 260/230 est dans les normes avec des écarts-types assez réduits suggérant une qualité homogène pour tous nos échantillons.

Cependant, les concentrations de l’ADN extrait sont assez fortes avec de grands écarts (écarts-types de ± 248,98 chez les infertiles et de ± 261,32 dans la cohorte de témoins). Cette particularité est en fait liée à la technique d’extraction de l’ADN utilisée (au NaCl).

La remesure de ces paramètres après dilutions de nos ADN aux ≈ 1/5^ième dans de l’eau distillée a été faite. La concentration des ADN est ramenée aux alentours de 100 ng/µl (103,49 ± 25,723 pour les infertiles et 110,11 ± 28,248 pour les témoins).

Ces dilutions ont été établies pour supprimer toute source d’erreur potentielle liée à la concentration de l’ADN utilisé, en particulier pour la PCR quantitative de l’ADNmt.

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