Analyse par SDHF de l’effet de la bléomycine couplée à l’électroporation

L’étude de ce paragraphe a pour but d’évaluer d’une part, la potentialisation de la bléomycine avec l’EP sur les cellules THP1, et d’autre part, la capacité de notre bio-capteur à détecter la perte de viabilité cellulaire induite par la rentrée des molécules de bléomycine grâce à l’EP. Dans ce but, 5 différents groupes cellulaires ont été étudiés :

 Groupe 1 : Cellules sans traitement, contrôle négatif

 Groupe 2 : Cellules traitées avec 0.02% de saponine, contrôle positif  Groupe 3 : Cellules traitées avec la bléomycine seule (à 250 nM/L)  Groupe 4 : Cellules traitées avec le champ électrique seul (à 1 kV/cm)  Groupe 5 : Cellules traitées avec ECT (250 nM de bléomycine + 1 kV/cm). Après le traitement, les cellules sont remises en culture pendant 24 heures, avant de procéder aux mesures hyperfréquences.

Vu le grand nombre de spectres obtenus à l’issue de cette étude, nous présenterons seulement les résultats des contrastes capacitifs et conductifs, à 5 GHz et à 30 GHz respectivement, comme le montre la Figure 104. De la même manière que précédemment expliquée, nous procédons à un tri cellulaire en nous basant sur les valeurs seuils déterminées pour chacun des paramètres HF.

Par comparaison aux cellules non traitées (mortalité basale à 20%), nous pouvons clairement établir que lorsque les cellules ne sont traitées qu’avec la bléomycine seule ou ne sont soumises qu’au champ électrique seul, la mortalité résultante n’est pas sensiblement affectée. Par contre, le traitement par la bléomycine couplée au champ électrique engendre une augmentation du nombre de cellules dépassant le seuil et présentant des signatures électriques caractéristiques de cellules mortes.

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(a)

(b)

Figure 104 : Contrastes (a) capacitif ∆C 5GHz et (b) conductif ∆G 30 GHz des cellules avec différents conditions de traitement.

Une quantification du pourcentage de cellules viables (Figure 105) après le traitement démontre l’effet potentialisant de l’effet combinée de la bléomycine et de l’EP (= ECT). Les cellules de contrôle négatif présentent un taux de viabilité aux alentours de 80%. L’EP seule n’a aucun impact sur la viabilité cellulaire et l’effet de la bléomycine n’est que mineur car la diminution de la viabilité n’est que de 10%. L’ECT, quant à elle, induit une nette diminution de la viabilité jusqu’à 50% révélée par ∆C et jusqu’à 35% révélée par ∆G.

Une comparaison statistique entre les résultats obtenus par spectroscopie diélectrique hyperfréquence et ceux obtenus à l’aide du test d’exclusion par le trypan bleu, montre une très bonne corrélation (R2 _{>0.97) entre les deux techniques, validant une fois de plus la précision de}

154 | P a g e Figure 105 : Comparaison de l’évolution des paramètres ∆C et ∆G extrait de l’analyse diélectrique hyperfréquence et des résultats obtenus avec le test d’exclusion au bleu de trypan.

IV.5 Conslusion

Ce paragraphe IV vous a présenté les résultats expérimentaux d’analyse par spectroscopie HF de cellules individuelles ayant subi différents traitements : chimiques, d’électroporation et enfin d’électrochimiothérapie.

Chaque expérience a été conduite avec un protocole biologique et de mise en œuvre de la spectroscopie HF strict et compatible avec les 2 domaines en synergie (biologie et électronique HF). Pour chaque test, une dizaine de cellules a été mesurée successivement (voir Figures 37, 40 et 45) et les données présentées aux figures 38 ,41 et 46 résultent d’expériences tripliquées (n=3) amenant à des conclusions « statistiquement acceptables » pour les biologistes.

Sur les 9 situations biologiques investiguées, la classification des niveaux des indicateurs de spectroscopie que sont les contrastes capacitif (∆C) à 5 GHz et conductif (∆G) à 30 GHz se révèle être en forte corrélation avec la viabilité cellulaire (R2_>0.94).

A notre connaissance, c’est la première fois que la spectroscopie HF (dans le domaine du GHz) de cellule unique révèle des résultats en très forte pertinence (corrélation très forte) avec des analyses croisées biologiques.

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V. Conclusion

Ainsi, au cours de ce dernier chapitre, nous avons démontré que la spectroscopie HF est capable de produire des données expérimentales de qualité reflétant les propriétés diélectriques de cellules individualisées. La capacité de notre biocapteur à discriminer l’état de viabilité cellulaire a été établi sur une dizaine d’expériences différentes classiquement faites en EP, chacune étant tripliquée et impliquant une dizaine de cellules analysées.

La classification de viabilité effectuée par spectroscopie a tout d’abord été calibrée en appliquant un traitement létal aux cellules avec une molécule chimique : la saponine. A l’issue de cette étude, nous avons défini une valeur seuil sur les deux paramètres diélectrique (∆C à 5 GHz et ∆G à 30 GHz) nous permettant d’établir la classification viable/non-viable. La classification qui s’en est suivie a été confirmée (corrélée) par des analyses biologiques. Fort de cette aptitude à la détermination par spectroscopie HF de la viabilité cellulaire, nous avons appliqué cette technique, avec toujours une dizaine de cellules testées et des expériences répliquées 3 fois, pour des traitements classiquement employés par les biologistes investiguant l’EP :

1. EP seule à 1 kV/cm et analyse après 24h, 2. EP seule à 1.5 kV/cm et analyse après 24h, 3. EP seule à 1.5 kV/cm et analyse après 3h, 4. EP seule à 1.5 kV/cm et analyse après 5h, 5. EP seule à 1.5 kV/cm et analyse après 7h,

6. Bléomycine seule à 250 nM et analyse après 24h,

7. Bléomycine à 250 nM et EP à 1 kV/cm (ECT) et analyse après 24h.

L’EP correspond à l’application de 8 impulsions électriques de durée 100 µs et de fréquence 1 Hz. Ces 7 tests, auxquels se rajoutent les contrôles positifs (cellules sans traitement) et négatifs (cellules traitées avec 0.02% de saponine), sont la résultante de 3 plans d’expérience :

 Analyse par spectroscopie HF de l’effet de l’intensité de champs d’EP  tests 1 et 2 pour des champs de 1 kV/cm puis 1.5 kV/cm

 Suivi post EP par spectroscopie HF  tests 3, 4, 5 et 2 pour un suivi post EP de 3, 5, 7 et 24h

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 Analyse par spectroscopie HF de la synergie EP + Bléomycine  tests 1, 6 et 7 pour l’EP seule, la Bléomycine seule et la combinaison des deux (=ECT).

L’ensemble des résultats expérimentaux montrent une excellente corrélation (R2_{>0.94) entre la}

spectroscopie diélectrique hyperfréquence et les méthodes d’analyse biologique ce qui révèle que la technique HF identifie, avec un degré de fiabilité identique à celui des « gold » standards de la biologie, la viabilité cellulaire.

En conclusion, dans ce chapitre de thèse, nous avons démontré que l’approche par spectroscopie diélectrique hyperfréquence associée aux microtechnologies permettant une analyse de cellules individualisées, est une technique fiable et performante pouvant analyser des cellules sous traitements chimiques et/ou électriques et permettant ainsi d’enrichir la vision que les biologistes peuvent avoir des cellules.

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