Analyse et quantification de l’expression de deux gènes d’Aquaporines TdPIP1.1 et TdPIP2.1

Afin de vérifier le profil d’expression de deux gènes d’Aquaporines TdPIP1.1 et TdPIP2.1 dans des feuilles et des racines de blé soumises à un stress hydrique, des analyses de PCR en temps réel ont été menées. Pour ce faire on procède de la façon suivante :

 Extraction des ARN totaux

 Rtrotranscription des ARNm en ADN complémentaire (ADNc)  Analyse de l’expression des gènes en qPCR

Extraction des ARNm (TRIZOL)

L’extraction de l'ARN a été effectuée suivant la méthode employée par (Rampino et al., 2006). Les échantillons ont été prélevés à partir des plantes stressées et non stressées et mises directement dans l’azote liquide. Les échantillons de 50-100 mg ont été préparés et homogénéisé en utilisant 1 ml de Trizol. Une fois homogénéisés, les échantillons sont incubés 5min à température ambiante.

Après on ajoute 200 µl de chloroforme et on agite pendant 15 sec. Les échantillons ont été incubés pendant 2-3 min à température ambiante puis centrifugé à 12000 rpm pendant 15 min à 4 ° C. après la centrifugation la phase aqueuse obtenue a été transférée dans un nouveau tube eppendorf contenant 500 µl d’Isopropanol. On Incube pendant 10 min à température ambiante.

42 Les échantillons ont été soumis à une centrifugation à 12.000 rpm15 min à 4°C. Le surnageant a été éliminé. Le culot d'ARN a été lavé avec 1 ml d'éthanol (75 %). L'échantillon a été agité au vortex et centrifugé à 1200 tpm pendant 5 minutes à 4 ° C).

Après avoir jeté le surnagent, le culot a été séché pendant 15 à 20 min puis solubilisé dans 30 µl de H2O DEPC. Enfin, les échantillons ont été incubés 10 min à 60° C. et conservés après à -80°C.

Purification de l’ARN

La purification de l’ARN a été effectuée sur colonne (The Spin colomn method) en utilisant le kit EZ-10 Spin Column Plant RNA Mini-Preps Kit (Annexe 05), les étapes de la purification ont été faites selon les instructions du fabricant.

Contrôle de la Qualité de l’ARN

L’intégrité des ARN est évaluée en utilisant le kit RNA 6000 Nano Lab Chip sur Bioanalyseur 2100 (Agilent Technologies, Inc.) (Figure 7) par mesure du RIN (RNA Integrated Number) (Schroeder, Mueller et al. 2006).

Comme la dégradation de l’ARN est un processus graduel, il existe en parallèle une diminution du ratio ARN ribosomal 18S / ARN ribosomal 28S et une augmentation du signal de base entre les deux pics ribosomaux .Développé afin de standardiser le contrôle de la qualité de l’ARN, le RIN prend en compte la totalité d’un tracé électrophorétique d’un échantillon d’ARN. L'algorithme du logiciel de la machine restitue donc une valeur permettant la classification de l’ARN total eucaryotique, basée sur un système de numérotation de 1 à 10, 1 étant le profil le plus dégradé et 10 étant le profil d’un échantillon intact.

Figure 7 : A) Bioanalyseur 2100 (Agilent indicatives de la qualité de l’ARN. Quality Control ".

Transcription inverse des ARNm en ADNc Principe

Le principe de la transcription inverse est de synthétiser un ADNc à partir d’une matrice d’ARN messager. Ceci est rendu possible grâce à une enzyme appelée communément transcriptase inverse. Cette technique permet de rétrotranscrire les ARNm en A

sujet à la dégradation, pour être amplifiés et mesurés par la suite par qPCR.

Il existe plusieurs types d’ARN : les ARN ribosomiques (ARNr), les ARN de transferts (ARNt), les ARN messagers (ARNm), les petits ARN nucléaires (ARNsn), les petits ARN nucléolaires (ARNsno).

Les ARNm, molécules monocaténaires, assurent la communication de l’information génétique entre le noyau et le cytoplasme. Après maturation, ils sont polyadénylés.

La fixation d’oligo-désoxyThymine (oligo

l’extrémité 3’ des ARNm va permettre à la transcriptase inverse de se fixer et de débuter la phase d’élongation.

A)

Bioanalyseur 2100 (AgilentTechnologies, B) Électrophorégramme détaillant les régions indicatives de la qualité de l’ARN. D’après" RNA Integrity Number (RIN) - Standardization o

Transcription inverse des ARNm en ADNc

Le principe de la transcription inverse est de synthétiser un ADNc à partir d’une matrice d’ARN messager. Ceci est rendu possible grâce à une enzyme appelée communément transcriptase inverse. Cette technique permet de rétrotranscrire les ARNm en A

sujet à la dégradation, pour être amplifiés et mesurés par la suite par qPCR.

Il existe plusieurs types d’ARN : les ARN ribosomiques (ARNr), les ARN de transferts (ARNt), les ARN messagers (ARNm), les petits ARN nucléaires (ARNsn), les petits ARN

Les ARNm, molécules monocaténaires, assurent la communication de l’information génétique entre le noyau et le cytoplasme. Après maturation, ils sont polyadénylés.

désoxyThymine (oligo-dT) à la queue polyAdénine (

l’extrémité 3’ des ARNm va permettre à la transcriptase inverse de se fixer et de débuter la B)

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Électrophorégramme détaillant les régions Standardization of RNA

Le principe de la transcription inverse est de synthétiser un ADNc à partir d’une matrice d’ARN messager. Ceci est rendu possible grâce à une enzyme appelée communément transcriptase inverse. Cette technique permet de rétrotranscrire les ARNm en ADNc moins sujet à la dégradation, pour être amplifiés et mesurés par la suite par qPCR.

Il existe plusieurs types d’ARN : les ARN ribosomiques (ARNr), les ARN de transferts (ARNt), les ARN messagers (ARNm), les petits ARN nucléaires (ARNsn), les petits ARN

Les ARNm, molécules monocaténaires, assurent la communication de l’information génétique

dT) à la queue polyAdénine (polyA) présente à l’extrémité 3’ des ARNm va permettre à la transcriptase inverse de se fixer et de débuter la

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Protocole

La synthèse d’ADNc simple brin est réalisée sur 2µg d’ARNtx en utilisant l’enzyme M-MLV Reverse Transcriptase (RNA-dépendent DNA polymerase ).

Le mélange réactionnel de 25 µl contient :
6µg d’ARN tx

5 µl Buffer 5X

1 µl de Random primer
1 µl de l’enzyme M-MLV.
Q.s.p 25 ml de H2O.

Le mélange est incubé à 37°C pendant une heure. Après incubation le mélange est dilué 20X.

 PCR en temps réel (real time PCR)

La quantification relative des transcrits des deux gènes TdPIP1.1 et TdPIP2.1 est réalisée par la PCR en temps réel (qPCR). Cette technique repose sur la possibilité de suivre au cours du temps (« en temps réel ») le processus de PCR à l’aide de la fluorescence. Elle permet de suivre la quantité d'ARN présente dans la réaction à tout instant et non à la fin de la PCR (PCR classique).

A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ARN est mesurée grâce à un marqueur fluorescent dont l’émission est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons produits. Les amorces spécifiques correspondantes aux gènes d’intérêt et de référence sont indiquées dans le tableau 4. Ces amorces sont choisies à partir de séquences publiées (Ayadi et al., 2011) ayant démontré une amplification spécifique aux gènes cibles.

Les analyses de qPCR sont effectuées à l’aide d’un thermocyleur de type LightCycler® 480 (Figure 08) avec l’utilisation de la technologie SYBR Green. L’ARN extrait est dilué préalablement à son utilisation comme matrice dans la qPCR, afin de réduire les inhibitions potentielles en cours d’analyse. Le mélange réactionnel contient l’ADN matrice 2µL d'ADNc, un couple d’amorces spécifiques (le sens et l’antisens) à 100uM de chacune et 2 X de Power SYBR Green PCR Master Mix (Life technologies). Le volume final de la réaction est de 8 µL.

Tableau 5 :

Le programme thermocycleur est le suivant: une dénaturation de 3min à 94 °C, 35cycles d’amplification et une élongation à

A)