Analyse qualitative des sérums sensibles à l’arachide

5.2 Détection des anticorps IgE sériques par la méthode microbilles ... 121

5.2.1 Description de la méthode ... 121 5.2.2 Lecture des résultats par assemblage gravitationnel ... 122 5.2.3 Lecture rapide des résultats par spectroscopie ... 126

5.3 Conclusion ... 129

Dans ce chapitre, nous allons nous intéresser à l’analyse des sérums de patient par la technologie microbilles en utilisant le travail présenté dans les chapitres 2, 3 et 4 consacrés au développement des différentes technologies appliquées aux microbilles. La méthode est subdivisée en plusieurs étapes de biofonctionnalisation, de réaction avec le sérum de patient, de tri magnétique, d’assemblage gravitationnel et de lecture des résultats.

Dans un premier temps, les analyses de contrôle seront effectuées sur les extraits d’allergènes et les sérums de patient.

Puis, nous décrirons la méthode utilisée, le principe et les étapes détaillées de la technologie microbilles qui s’oriente vers le diagnostic des allergies développés au sein du laboratoire LTM. Des tests cliniques qualitatifs et quantitatifs seront effectués avec des sérums de patient sensibles à l’arachide, la noisette ou la crevette.

Les performances de notre outil de diagnostic seront évaluées et une comparaison des tests cliniques sera effectuée avec les technologies actuelles.

5.1 Préparation des analyses du sérum de patient

Tout d’abord, des tests de contrôle sont effectués sur les extraits d’allergènes et les sérums de patient pour s’assurer qu’ils sont bien réactifs entre eux.

5.1.1 Analyse qualitative des sérums sensibles à l’arachide

5.1.1.1 Etape 1 SDS-PAGE

Les extraits d’allergènes sont analysés avant l’étape de biofonctionnalisation par la méthode SDS-PAGE107 (Sodium Dodecyl Sulfate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis). C’est une technique qui permet d’analyser les protéines contenues dans une solution par séparation en fonction de leur masse moléculaire sur un gel à base de polyacrylamide. Le laurylsulfate de sodium (SDS) est un détergent ionique qui a pour fonction de se fixer sur la chaîne polypeptidique de la protéine via sa longue chaîne carbonée grâce à des interactions hydrophobes. Cette molécule se fixe sur la protéine avec une proportion d’une molécule de SDS pour 2 acides aminés108. Le groupement sulfate portant une charge négative, le complexe formé possède un nombre de charges proportionnel à la quantité d’acide aminé et à son poids moléculaire. L’électrophorèse de la solution de protéine est effectuée dans un gel polyacrylamide dont la taille des pores est contrôlée. Comme le montre la figure 5.1, une protéine de petite taille traverse les pores du gel plus rapidement et effectue une plus grande distance qu’une protéine de taille supérieure. Ainsi, les protéines sont séparées sur le gel en fonction de leur masse moléculaire. La coloration au bleu de Coomassie permet de visualiser directement les protéines qui forment des bandes protéiques. La distance parcourue par les protéines est révélée par la position des bandes protéiques sur le gel et indique le poids moléculaire des protéines isolées.

Le tableau 5.1 présente les poids moléculaires des différents allergènes moléculaires de l’arachide dont la présence dans l’extrait d’allergène est nécessaire58 pour un diagnostic efficace. Ces allergènes (Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 8 et Ara h 9) sont utilisés sous forme

pure par la technologie ImmunoCAP® pour détecter et évaluer la concentration des anticorps IgE spécifiques.

La figure 5.2 montre le résultat du test SDS-PAGE sur l’extrait d’arachide fourni par le laboratoire de Toulouse. À gauche, on remarque la position des bandes protéiques (en bleu) révélant la présence de différentes protéines contenues dans l’extrait d’arachide. À droite, des repères ont été placés pour indiquer la masse des protéines exprimée en kDa. Les résultats révèlent la présence des allergènes cités précédemment dont la présence dans l’extrait d’allergène est indispensable pour le diagnostic d’allergies58.

5.1.1.2 Etape 2 : Western Blot

Cette technique permet de mettre en évidence la présence et la fonction de reconnaissance des anticorps primaires spécifiques IgE sur les allergènes de manière qualitative. Les protéines de l’extrait d’arachide sont séparées par la technique SDS-PAGE (figure 5.3a) comme décrit dans la section 5.1.1, puis transférés sur une membrane de nitrocellulose. Ces membranes sont incubées avec du sérum de patient pour permettre aux anticorps spécifiques IgE de se fixer sur les allergènes (figure 5.3b). Après lavage, une solution d’anticorps secondaires marqués à un enzyme est ajoutée pour révéler les anticorps spécifiques IgE par chimiluminescence CLIA (figure 5.3c). La séparation spatiale des allergènes sur la membrane de nitrocellulose permet l’identification individuelle des anticorps spécifiques IgE.

Allergènes de l’arachide Ara h 1 Ara h 2 Ara h 3 Ara h 8 Ara h 9

Poids moléculaire (en kDa) 63.5 20 45 16.8 10

Figure 5.2 : Electrophorèse d’un extrait d’arachide mettant en évidence la présence des allergènes : Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 8 et Ara h 9.

La figure 5.4 montre les tests Western Blot effectués par le laboratoire de Toulouse avec des sérums de forte, moyenne et faible concentration en anticorps IgE dirigés vers l’extrait d’arachide. Les concentrations sont indiquées sur la figure : 95.8 UI/ml, 15.7 UI/ml et 0.1 UI/ml avec 1 UI/ml = 2.4 ng/ml. La colonne de gauche est constituée de repères permettant d’identifier la masse moléculaire des protéines en kDa. La révélation effectuée par chimiluminescence indique un signal positif par la présence d’une tache noire. On remarque un signal important pour les sérums forts, une intensité faible pour les sérums intermédiaires et un signal nul pour les sérums faibles. De plus, une intensité importante aux emplacements des allergènes majeurs de l’arachide es observée. Cela confirme la réaction des anticorps du sérum avec les allergènes de l’arachide mise en évidence par le test SDS – PAGE (section 5.1.1).

Figure 5.3 : Schéma de principe de la technique « Western Blot ».

Figure 5.4 : Analyse qualitative des 3 sérums de patient sensible à l’arachide de concentrations d’IgE différentes par la méthode Western Blot.