Analyse protéomique de la MAH

1.1.3.1. Extraction Protéique

Les MAH C ont été décongelées à température ambiante pendant 20 minutes. Puis les MAH C décongelées et les MAH L ont été placées dans 5 mL de PBS [Gibco] pendant 10 minutes avec un changement de bain de PBS au bout des 5 premières minutes. Les membranes de nitrocellulose ont été retirées pour chacune des conditions testées et les surplus de PBS ont été éliminés par une centrifugation de 2 minutes à 800 g à température ambiante. Les MAH ont ensuite été pesées. Par la suite chaque échantillon a été placé dans 0,5 mL de tampon RIPA (Radioimmunoprecipitation assay buffer) [Sigma] contenant des inhibiteurs de protéases et de phosphatases [Thermo scientifique]. La dilacération du tissu a été effectuée à l’aide de billes de silice [Precellys®] avec l’appareil Precellys 24 [Bertin] : 4 à 5 cycles de 6000 tours pendant 30 secondes. Entre chaque tour les échantillons ont été placés dans de la glace afin de décanter la mousse produite par l’agitation. Les tubes ont été centrifugés à 16 000 g pendant 7 minutes et 30 secondes à température ambiante et le surnageant contenant les protéines a été récupéré et dosé ou conservé à -80°C.

1.1.3.2. Dosage des protéines totales

Le dosage des protéines totales a été effectué par colorimétrie à l’aide du kit BCA (Bicinchoninic Acid Protein) [Thermo Fisher Scientific] et d’une gamme étalon de BSA (Bovine Serum Albumin) de 0 à 2 000 μg/mL puis une lecture au spectrophotomètre [Eppendorf, Biphotometre] à 562 nm a été réalisée.

1.1.3.3. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

L’analyse protéomique ciblée a été réalisée par ELISA avec un kit commercial selon les instructions du kit [Biotechne, R&D systems]. Les facteurs de croissance ciblés ont été l’EGF, le HGF, le KGF, le NGF et le TGF- Les anticorps (Ac) de capture ont été coatés dans des puits de plaque ELISA pendant la nuit à température ambiante. Par la suite une étape de lavage a été réalisée en 3 fois avec du PBS [Eurobio] et 0.05% de Tween 20 [Fisher Scientifique]. Par la suite les Ac de capture ont été bloqués avec 1% de BSA Tween 20 (block buffer) pendant 1 heure à température ambiante. L’Ac de capture du TGF- a été bloqué

73 avec du PBS Tween 20 à 5%. S’en est suivi l’étape de lavage et l’incubation avec l’anticorps de détection pendant 1 heure à température ambiante. Après une étape de lavage, la Streptavidine-HRP a été ajoutée et incubée à l’obscurité pendant 20 minutes à température ambiante. La solution de substrat (1/1 H2O2 + Tetramethylbenzeidine) a été ajoutée et incubée pendant 20 minutes à température ambiante. La réaction a été arrêtée avec de l’acide sulfurique à 2N. Les résultats ont été lus à densité optique (DO) de 450 nm avec le spectromètre [Multiskan FC microplate reader, Thermo Fisher].

1.1.3.4. Label-Free

L’approche « Label-free » est une technique de quantification des protéines par spectrométrie de masse en haute résolution. Cette approche consiste à comparer la quantité relative des peptides résultants d’une protéolyse globale entre plusieurs échantillons. L’ensemble des expérimentations présentées ci-dessous a été réalisé en collaboration avec la plateforme de protéomique PISSARO (IRIB).

Dans un premier temps, une extraction protéique sur les tissus « Congelés » (n=15) et « Lyophilisés » (n=14) a été réalisée. La technologie FastPrep [MP BiomedicalsTM, instrument FastPrep-24TM 5G], permettant un broyage mécanique simultané et homogène de tous les échantillons, a été utilisée. Brièvement, les tissus ont été lavés au PBS 1X puis placés dans un tube de matrice de lyse [Matrix Lysis D, MP BiomedicalsTM] dans 500µL d’un tampon de solubilisation 2R2D (Urée 7 M, Thiourée 2M, DTT 20 Mm, C7BzO 0.5% Chaps 2% et TBF 0.005%). Le broyage a été effectué en 4 cycles de 40 secondes à 6m/s. Les broyats ont ensuite été centrifugés (10000g, 8min, 4°C) et la fraction protéique présente dans le surnageant a été récupérée et conservée à 4°C pour les analyses ultérieures.

Dans un second temps, la concentration protéique de chaque échantillon a été calculée avec la méthode Bradford et lu à 595nm [Victor3 1420, Perkin Elmer]. Afin de valider les dosages protéiques, un gel SDS-PAGE (12,5% d’acrylamide) sur 6 échantillons aléatoires (5 µg) a été réalisé. Après migration, la coloration au NiAg du gel a permis de vérifier l’intensité des bandes protéiques pour chaque échantillon et ainsi écarter l’hypothèse d’une mauvaise estimation de la concentration protéique. Cette étape est primordiale car une erreur de concentration d’un échantillon engendrerait des différences majeures lors de l’analyse quantitative différentielle.

74 Dès lors que le dosage Bradford a été réalisé et validé, le protocole « Label free » peut alors être entrepris. Pour chaque échantillon, 25µg de protéine ont été déposés sur un gel de polyacrylamide 7% puis une migration (10mA/gel pendant 1h10) a été lancée afin de « piéger » l’ensemble des protéines dans un volume minimum de matrice « gel ». Une étape de coloration et de décoloration au bleu de Coomassie a permis de visualiser les bandes protéiques qui ont ensuite été découpées, prélevées dans un tube Eppendorf, puis lavées à l’aide de plusieurs bains d’eau milliQ. A la suite de cette migration, la digestion trypsique a été lancée.

Le protocole de digestion permet de découper les protéines au niveau des résidus aminés lysine et arginine pour obtenir un pool peptidique. Brièvement, les bandes protéiques ont dans un premier temps été réduits (DTT 5mM) puis alkylés (Iodoacétamide 20mM). Cette étape évite la formation de pont disulfure difficile à appréhender lors des analyses de spectrométrie de masse. Dans un second temps les bandes ont été déshydratées (Acétonitrile (ACN) 100%) puis séchées au Speedvac. Puis, elles ont été incubées toute la nuit à 37°C en présence de trypsine (ratio 1:20). Ensuite, les peptides obtenus lors de l’incubation ont été récupérés à l’aide de bains successifs de TFA 0,1% puis d’ACN 100%. Les fractions peptidiques obtenues ont à leur tour été séchées et conservées à température ambiante jusqu’à l’analyse par spectrométrie de masse.

A ce stade les échantillons ont été gardés à température ambiante en attendant d’être analysés.

Avant de lancer les analyses de spectrométrie, les fractions peptidiques séchées ont été reprises dans de l’acide formique 0,1% à une concentration de 1µg/µL puis dilué au 1/5ème. Les échantillons ont alors été placés dans une puits spécifique puis injectés (1µL) dans une chaîne chromatographique (HPLC) couplée à un spectromètre de masse haute résolution [Orbitrap, Thermo]. Les méthodes de chromatographie et de masse ont été réalisées et validées par la plateforme PISSARO. Les datas obtenus suite à cette analyse ont été traités par deux logiciels différents. L’analyse d’identification a été réalisé grâce au logiciel Proteome DiscovererTM et les analyses de quantifications par la logiciel Progenesis.

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