1. Caractérisation de la régulation post-traductionnelle de MTMR13 induite par
1.1. Analyse par spectrométrie de masse des modifications post-traductionnelles
Dans un premier temps, les différents types de modifications post- traductionnelles régulant MTMR13 ainsi que leurs sites ont été analysés par spectrométrie de masse. Cette méthode permet la caractérisation de toutes les modifications connues qui vont conférer une masse supplémentaire aux peptides analysés, obtenus après digestion par une protéase des protéines immunoprécipitées. Parmi celles-ci, nous nous sommes intéressées plus particulièrement à l’ubiquitination, l’acétylation et la phosphorylation, qui sont principalement associées à la régulation du processus de l’autophagie (Wani et al., 2015). Afin de caractériser les modifications nécessaires à l’activation de MTMR13 lors de l’induction de l’autophagie, les expériences sont réalisées en conditions de carence complète. Nous nous attendons à visualiser par spectrométrie de masse les modifications activatrices de MTMR13 à 15 min de carence en comparaison de la condition nutritive.
1.1.1. Analyse dans les HeLa et HCT116 de GFP :MTMR13
HeLa GFP:MTMR13 HCT116 GFP:MTMR13
Expérience 1 Expérience 2 Expérience 1 Expérience 2
CTL IP Nourrie Carence CTL IP Nourrie Carence CTL IP Nourrie Carence CTL IP Nourrie Carence Razor + peptide unique 1 99 100 0 92 86 0 88 91 2 80 79 Pourcentage de couverture 55,4 56 53 53,3 56,1 56,7 1,8 54,5 52,9 Compte de MS/MS 0 187 198 0 222 183 0 194 277 0 266 191 Intensité 2,1.106 1,3.1010 1,4.1010 0 2.1010 1,6.1010 0 2,95.1010 4,3.1010 7,8.106 6,4.1010 3.1010
Tableau 8- Résultats de l’identification de la protéine MTMR13 dans les lignées HeLa et HCT116 GFP:MTMR13
Entre 79 et 100 peptides uniques à MTMR13 ou communs à une isoforme de MTMR13, ont été identifiés (tableau 8) représentant un pourcentage de couverture de MTMR13 de 54,7% en moyenne pour les deux lignées différentes. Les peptides détectés sont répartis tout le long de la protéine et notamment en position C-terminale (représentés par des traits violets sur le schéma 9-C). 5 peptides phosphorylés ont été identifiés (tableau 9) avec un score supérieur à 20. Plus le score est élevé et plus le peptide phosphorylé est significatif. La probabilité de phosphorylation, permet
également d’appuyer le score. Située entre 0 et 1, elle représente 0% à 100% de chance que la phosphorylation soit présente sur l’acide aminé. Donc, les phosphorylations caractérisées sur la sérine 1104, la thréonine 1125 et la sérine 1687, ayant un score élevé et une probabilité respective de 0,791, 0,996 et 1, sont significatives. La position des deux autres phosphorylations est moins certaine, mais les peptides ont été préalablement identifiés comme phosphorylés dans d’autres études répertoriées sur le site Phosphosite, ce qui appuient la présence de la modification mais pas sa position. Ces sites sont localisés au niveau du domaine myotubularine phosphatase ou proche du domaine PH
(figure 9-C). Cependant, en comparant l’intensité de chaque peptide phosphorylé
caractérisé en condition de carence ou nourrie, une variation importante est observée entre les expériences. Il fut donc impossible par cette approche de déterminer si ces modifications sont régulatrices de MTMR13.
1.1.2. Analyse de MTMR13:GFP endogène
Bien que le système Flp-In™ T-Rex™ permette une expression faible de la protéine d’intérêt, il s’agit néanmoins d’un système de surexpression. Afin de confirmer les résultats obtenus sur la protéine endogène, une lignée HeLa, dont un allèle exprime MTMR13 fusionnée à la GFP, a été générée au laboratoire grâce à la technique de Crispr-Cas9. Du fait de la faible expression de la protéine, nous avons choisi la technique de digestion en gel dans le but de concentrer la protéine et de diminuer la proportion de protéines « contaminantes » pour l’analyse des modifications.
Entre 79 et 84 peptides uniques à MTMR13 ou communs à une isoforme ont été identifiés, correspondant à un pourcentage de couverture de la protéine de 50% en moyenne (tableau 10). 2 sérines phosphorylées ont été identifiées : la sérine 1687 également caractérisée dans les lignées de surexpression et la sérine 1263 identifiée avec un score de 71 et une probabilité de 0,993 (figure 9-C). De façon intéressante, elle est localisée sur le peptide PAFALS(Ph)PGTER, qui appartient à une isoforme de la protéine différente de celle clonée (PAFALSPGVWASLR) dans les HeLa et HCT116
(tableau 9). Cependant, les autres sites phosphorylés identifiés dans les lignées F/T
stables n’ont pas été identifiés sur la protéine endogène. De même que pour les lignées stables, il est difficile de conclure si la présence de la phosphorylation est favorisée par une condition en se basant sur les intensités.
Tableau 9- Peptides de MTMR13 phosphorylés identifiés par spectrométrie de masse
HeLa GFP:MTMR13 HCT GFP:MTMR13 CRISPR MTMR13:GFP
Expérience 1 Intensité Expérience 2 Intensité Expérience 1 Intensité Expérience 2 Intensité Expérience 1 Intensité Expérience 2 Intensité
Séquence Modifications Position de la modification
Probabilité de phosphorylation
du site
Score Nourrie Carence Nourrie Carence Nourrie Carence Nourrie Carence Nourrie Carence Nourrie Carence
ASEKSTME
QLVEK Non modifié 45,99 1,8.107 2,5.107 ASEKS(Ph)T
MEQLVEK 1 Phospho (STY) 1104
AS(0,008)EKS(0 ,791)T(0,201)M EQLVEK 50,47 1,72.107 1,9.107 1,5.107 3,5.107 LGLGTISGS SSR Non modifié 167,9 2,3.108 2,3.108 3,93.108 2,9.108 6,9.108 1,1.109 7,7.108 6,2.108 1,5.108 2,2.108 2,7.108 3,2.108 LGLGT(Ph)I SGSSSR 1 Phospho (STY) 1125 LGLGT(0,996)IS (0,003)GS(0,001 )SSR 66,5 5,6.10 6 8,4.106 1,2.107 1,3.107 2,1.107 3,3.107 1,6.107 PAFALSPGT ER Non modifié 49,4 5,8.106 6,4.106 PAFALS(Ph)
PGTER 1 Phospho (STY) 1263
PAFALS(0,993)
PGT(0,007)ER 71,6 5,7.106 6.106 1,9.107 1,9.107 SPGIVSTNL
PSYQK Non modifié 162,3 6,3.107 5,9.107 2,1.108 2,9.108 7,3.108 1,1.109 2,3.109 9,5.108 1,6.108 2,1.108 2,2.108 2,5.108
S(Ph)PGIVS
TNLPSYQK 1 Phospho (STY) 1687
S(1)PGIVSTNL
PSYQK 79,6 2,5.107 2,3.107 8,7.106 2,6.107 5,8.107 1,12.10
7 1,38.107
LISSPTSFID
VGAR Non modifié 79,9 5,3.108 2,9.107 7,9.108 5,98.108 LIS(Ph)S(Ph) PTSFIDVGA R 1 Phospho (STY) 1278 ou 1279 LIS(0,4)S(0,4)PT (0,1)S(0,1)FIDV GAR 30,1 2,5.107 2,6.107 3,3.107 VNRPGWNE DDDVSVSD ESELPTSTT LK Non modifié 16,5 9,1.108 7,95.108 1,4.109 VNRPGWNE DDDVS(Ph) VS(Ph)DES( Ph)ELPTSTT LK 1 Phospho (STY) 1085 ou 87 ou 90 VNRPGWNED DDVS(0,31)VS( 0,31)DES(0,31)E LPT(0,033)S(0,0 18)T(0,011)T(0,0 07)LK 20,7 7,6.107 1,7.108
Crispr MTMR13:GFP
Experience 1 Expérience 2
CTL IP Nourrie Carence CTL IP Nourrie Carence
Razor + peptide unique 0 80 81 3 84 79
Pourcentage de couverture 48 48,3 53,7 50,5
Compte de MS/MS 176 203 146 143
Intensité 0 5,48.109 8,53.109 5,63.106 7,62.109 7,55.109
Tableau 10- Résultats de l’identification de la protéine MTMR13 de la lignée HeLa MTMR13:GFP endogène
1.1.3. Analyse de GFP:DENN, le domaine catalytique permettant l’activation de RAB21
Dans le but de décompléxifier les échantillons et d’identifier plus spécifiquement les sites modifiés selon les domaines de la protéine, le domaine DENN fusionné à la GFP a été également analysé par spectrométrie de masse après 15 min de carence en sérum et acides aminés.
HeLa GFP:DENN HCT116 GFP:DENN
Expérience 1 Expérience 2 Expérience 1 Expérience 2
CTL IP Nourrie Carence CTL IP Nourrie Carence CTL IP Nourrie Carence CTL IP Nourrie Carence
Razor + peptide unique 1 22 25 0 30 29 3 30 32 4 24 22 Pourcentage de couverture 50,7 57,7 69,2 66,9 69,2 73,8 55,4 50,7 Compte de MS/MS 0 237 202 0 229 199 0 888 755 0 232 156 Intensité 7,9.107 2,8.1011 2,9.1011 0 1,61.1011 1,3.1011 8,8.107 5,6.1011 2,6.1011 3,5.106 1,6.1011 6,8.1010
Tableau 11- Résultats de l’identification de la protéine MTMR13 dans les lignées HeLa et HCT116 GFP:DENN
Entre 22 et 32 peptides uniques à MTMR13 ou communs à une isoforme de la protéine ont été identifiés représentant un pourcentage de couverture du domaine DENN de 61,7% en moyenne pour les deux lignées (tableau 11). En comparant la répartition de ces peptides sur le domaine DENN seul par rapport à ceux identifiés lors de l’analyse de la protéine entière (figure 9-C), l’analyse du domaine seul a permis d’augmenter le nombre de peptides identifiés. Cependant, aucune phosphorylation ou autre modification n’a pu être visualisée.
Les analyses par spectrométrie de masse ont permis d’identifier des sites phosphorylés mais aucun ne semble dépendant de l’induction de la carence en nutriment.
1.2. Analyse des interacteurs par spectrométrie de masse, lors de l’induction de