a. Séquençage haut débit nouvelle génération (NGS)
Le séquençage haut débit nouvelle génération (NGS), ou séquençage massivement parallèle, est un ensemble de techniques de séquençage de l’ADN développées après l’ère Sanger, et ayant révolutionné l’ère de la recherche génomique. La technique la plus utilisée est le séquençage par synthèse, grâce aux appareils Illumina. De nos jours, le séquençage complet d’un génome humain peut être réalisé en une journée, tandis qu’il a fallu plus de 10 ans avec la technique de Sanger pour obtenir le séquençage complet du génome humain.
57 Il existe plusieurs plateformes de séquençage différentes, toutes fonctionnant en séquençant des millions de petits fragments d’ADN en parallèle. Les analyses bio-informatiques sont ensuite utilisées afin de regrouper ces séquences et de les aligner sur le génome humain de référence. Les trois milliards de bases sont séquencées de multiples fois, ce qui permet d’obtenir une profondeur de séquençage élevée, permettant de détecter avec précision de simples variations nucléotidiques. Le NGS peut être utilisé afin de séquencer un génome humain entier, ou bien seulement des zones d’intérêts comprenant les régions codantes des 22 000 gènes connus (ce que l’on appelle séquençage d’exome), ou bien un plus petit nombre d’exons codants parmi des gènes d’intérêt impliqués dans des phénotypes similaires en pathologie (panels de gènes). Le séquençage d’exome est très utilisé dans la recherche de maladies rares, il couvre seulement 1% du génome humain codant mais reste la méthode la plus courante du fait de son efficacité à la fois en termes de coût, mais également en termes de temps de réalisation. Les panels de gènes quant à eux, sont exécutés très rapidement, entraînent moins de données incidentes et soulèvent ainsi moins de questions éthiques. Ils ont une meilleure couverture du fait d’un plus faible nombre de régions analysées, permettant une meilleure détection des variations du nombres de copies et des mutations somatiques en mosaïque, par rapport au séquençage d’exome(77).
Définitions du NGS et de la technique de Sanger(78,79) :
Bien que de nos jours le NGS soit la technique la plus largement utilisée pour les diagnostics moléculaires, ces deux techniques ont une propriété commune : elles sont basées sur le principe de la réplication de l’ADN.
Dans la technique de Sanger, développée en 1977, le recopiage d’un brin matrice par l’ADN polymérase est initié par la fixation d’une amorce complémentaire au brin matrice. L’ADN polymérase incorpore des nucléotides libres présents dans le milieu réactionnel, ainsi que de manière aléatoire, des didéoxynucléotides (ddNTP) interrupteurs de chaînes également présents dans le milieu réactionnel.
Ces ddNTP ont une extrémité 3’H empêchant la formation de la liaison phosphodiester entre le ddNTP incorporé et le nucléotide suivant. Chaque ddNTP est marqué par un fluorochrome différent. Par technique de migration électrophorétique, les fragments séquencés vont migrer sur un gel en fonction de leur masse moléculaire. Une analyse spectrale va différencier les différents fluorochromes pour associer la base correspondante et ainsi définir la séquence nucléotidique du brin d’ADN initial.
Le NGS s’appuie également sur la détection de fluorescences différentes des bases de l’ADN au cours du séquençage, mais plutôt que d’exploiter la séparation par la taille, le NGS utilise la séparation selon la position lors de l’incorporation de la base fluorescente. L’ADN à séquencer est fragmenté en
58 morceaux d’environ 400 paires de bases, qui vont être hybridés sur un support de séquençage, une lame de verre, la Flow Cell. Le séquençage se déroule en plusieurs cycles où chaque cycle correspond à l’identification d’une base. Chaque fragment est amplifié de nombreuses fois afin d’obtenir une fluorescence détectable par le séquenceur. Contrairement à la technique de Sanger, toutes les bases présentes dans le milieu réactionnel sont fluorescentes et présentent un terminateur de chaîne. La polymérase incorpore un nucléotide, puis une caméra va prendre une photo de la Flow Cell afin de détecter le signal de fluorescence du nucléotide introduit. Ensuite une étape de lavage va permettre d’effacer la fluorescence et le terminateur de chaîne, afin que le cycle suivant puisse se dérouler avec incorporation du nucléotide suivant, et ce jusqu’à l’obtention de la séquence complète.
Au terme de ces étapes, de multiples petites séquences d’ADN sont obtenues, regroupées dans des fichiers informatiques, puis alignées sur le génome de référence. La détection de variations de séquences entre l’ADN du patient et le génome de référence, nécessite ensuite des étapes rigoureuses de documentation afin d’interpréter au mieux la variation, en évaluant un lien de causalité entre la variation détectée, et le phénotype présenté par le patient. Le véritable défi est d’arriver à ne retenir que quelques variations d’intérêt diagnostique, qui seront classées selon les recommandations de la Société Américaine de Génétique Médicale (ACMG) en variant pathogène, probablement pathogène, de signification inconnue, probablement bénin ou bénin. Cette classification s’effectue au moyen de différentes bases de données, de logiciels de prédiction de la pathogénicité d’une variation, de tests biologiques pour étude de ségrégation familiale et de tests fonctionnels.
59 Figure 15 – Techniques du NGS et séquençage par Sanger qui reposent sur le principe de la réplication de l’ADN (Muzzey et al., Curr Genet Med Rep, 2015)
Avantages du NGS par rapport à la technique classique de séquençage capillaire Sanger :
-Le NGS permet de détecter un plus grand nombre de variations génomiques par rapport à la technique traditionnelle de Sanger. Les différentes variations génomiques comprennent des substitutions, des insertions ou délétions, de plus larges délétions d’exons ou de gènes complets, des réarrangements comme les inversions ou translocations. La technique de Sanger était restreinte à la découverte de substitutions ou petites insertions et délétions. La mise en évidence des autres types de mutations
60 était obtenue par d’autres techniques comme l’Hybridation in situ en fluorescence (FISH) ou bien l’Hybridation comparative génomique (CGH). Toutes ces données peuvent maintenant être obtenues grâce au NGS, les seules limitations résidant dans le risque d’erreurs dans les zones de répétitions de nucléotides.
-L’avantage du NGS réside également dans le fait de pouvoir réaliser un séquençage à l’échelle génomique, soit séquençage de l’exome (WES), soit séquençage du génome entier. Cette méthode permet d’impliquer de nouveaux gènes en pathologie, sans hypothèse préalable sur d’éventuels gènes ou locus candidats. Le NGS a aussi permis de préciser cliniquement les larges spectres phénotypiques associés à des mutations dans un même gène. Des avancées majeures ont pu être réalisées dans le diagnostic des causes génétiques des retards de développement chez l’enfant, en séquençant l’ADN des enfants et de leurs parents, permettant d’obtenir de nouvelles mutations en comparant les séquences obtenues, analysées en prenant en compte les données phénotypiques et le mode de transmission suspecté (autosomique dominant ou récessif, transmission liée à l’X, ou bien hypothèse d’une mutation de novo). Une autre approche consiste à analyser les exomes ou les génomes d’un groupe de patients ayant des caractéristiques cliniques similaires, et de filtrer les variants présents dans un gène commun aux membres du groupe.
-Le NGS est plus sensible que la technique de Sanger pour détecter des variations somatiques en mosaïque présentes dans un faible pourcentage de cellules. Les méthodes actuelles permettent la détection de très faibles taux d’allèles mutés, jusqu’à 1%. Le résultat est exprimé en pourcentage d’allèles mutés (ce que l’on nomme la fraction allélique), il reflète la proportion de cellules affectées par la mutation, au sein de l’échantillon tissulaire prélevé. La sensibilité peut être améliorée en augmentant le nombre de lectures des portions d’ADN à séquencer, et ainsi la profondeur de séquençage. Les mutations en mosaïque détectées doivent ensuite être validées par une seconde méthode indépendante, en général la technique de Sanger(80).
Afin de mettre en évidence des mutations en mosaïque, il est nécessaire d’obtenir un échantillon du tissu sur lequel on souhaite réaliser l’extraction d’ADN. Dans les pathologies cutanées en mosaïques, une biopsie de peau est réalisée en peau lésée afin d’extraire l’ADN et de mettre en évidence la variation et déterminer sa fraction allélique.
Le NGS a également la sensibilité requise pour détecter l’ADN fœtal circulant à partir d’un échantillon sanguin maternel, ou bien des cellules tumorales à partir d’échantillons sanguins de patients.
-Enfin, le NGS ouvre la voie à de nouveaux traitements prometteurs, à partir de nouveaux diagnostics moléculaires établis en pathologie. En oncologie, le séquençage génomique de tumeurs permet de découvrir de nouveaux gènes impliqués, et parfois des mutations pouvant être ciblées par des thérapeutiques spécifiques.
61 Figure 16 - Mise en évidence d’une mutation somatique BRAF V600E, par technique NGS et Sanger (Behjati et al., Arch Dis Child Educ Pract Ed, 2013)
Les limites du NGS :
La couverture du séquençage n’est pas de 100%, ainsi le risque est de ne pas détecter certains variants, et d’avoir de faux positifs. Également, la difficulté est de filtrer les variants candidats et de les interpréter correctement. Il y a également des enjeux éthiques à propos de la communication au patient des données incidentes, qui sont des variations de signification pathologique, sans relation directe avec l’indication initiale et de découverte fortuite au cours du séquençage.
62 Démontrer la causalité d’un variant est complexe lorsque le gène en question n’a jamais été décrit en pathologie humaine, ou bien associé à un phénotype différent. Les études fonctionnelles et de ségrégation familiale aident à confirmer le lien de causalité. Dans les dermatoses en mosaïque, la détermination de la fraction allélique et la comparaison de la séquence obtenue avec celle présente dans un tissu sain de référence, permet de confirmer ou au contraire d’infirmer le variant suspecté.
Une autre limite du NGS est la difficulté à détecter des mutations dans des régions non codantes, qui pourraient représenter environ 80% du génome humain. Ces régions non codantes peuvent contenir des variations ayant des répercussions sur l’épissage, des régions 3’ régulatrices, des ARN non codants, des interactions directes avec des facteurs de transcription, et sont évaluées par l’étude du transcriptome.
Application du NGS à notre projet de recherche :
A partir de biopsies cutanées en peau albinos et sur éphélides étoilée, nous allons extraire l’ADN puis effectuer un séquençage ciblé du gène OCA2. Nous émettons l’hypothèse qu’une des réversions génétiques décrites ci-dessus serait en cause, à l’origine d’une restauration de la mélanogenèse se traduisant par des éphélides étoilées dans l’albinisme oculo-cutané de type II. Ainsi, nous pourrions mettre en évidence une mutation somatique en mosaïque sur l’un des deux allèles mutés dans le gène OCA2, permettant par exemple la restauration d’un cadre de lecture fonctionnel sur le transcrit OCA2, et ainsi une mélanogenèse efficace. Il pourrait aussi s’agir d’une seconde mutation compensatrice, ou bien d’un mécanisme de recombinaison homologue.
b. Microscopie confocale
Définition :
La microscopie confocale par réflectance in vivo est un outil novateur d’imagerie cutanée non invasive permettant l’observation en temps réel de l’épiderme, de la jonction dermo-épidermique et du derme superficiel papillaire à un niveau de résolution cellulaire, proche de l’histologie(81,82).
De l’huile d’immersion est appliquée sur la peau pour permettre la pénétration de la lumière. Un laser à diode à 830 nm est dirigé sur la peau jusqu’à une profondeur de 200 microns. La lumière émise par le laser est réfléchie par le tissu, puis recueillie par l’objectif et transmise à un détecteur, après passage par un diaphragme qui permet de recueillir sélectivement la lumière provenant de la région d’intérêt, à l’exclusion de la lumière des régions sus et sous-jacentes, permettant l’obtention d’images en coupes horizontales. L’image complète est ensuite reconstruite point par point par balayage du laser à la surface cutanée, en niveaux de gris selon l’indice de réflectance des molécules contenues dans les
63 tissus et cellules de la peau. Les composants cutanés très reflétants sont essentiellement la mélanine, mais également la kératine, les cellules de Langerhans, et apparaissent blancs et brillants. A l’inverse, le collagène apparaît gris et le sérum ou l’air dont l’indice de réflectance est faible sont noirs.
Le contraste cellulaire apparaît également lorsque la mélanine est présente en faible quantité, grâce à la luminosité de certains organites intracellulaires ou des structures environnantes.
Figure 17 – Représentation de l’appareil de microscopie confocale, et vue schématique et principe de fonctionnement du microscope confocal par réflectance (Kanitakis et al., Ann Dermatol Venereol, 2013)
64 Figure 18 – Indice de réflectance des différentes molécules endogènes de la peau (Gonzalez et al., Reflectance Confocal Microscopy of Cutaneous Tumors, 2008)
Intérêts :
La microscopie confocale aide dans le diagnostic différentiel des macules pigmentées du visage, permet de déterminer les limites des marges d’exérèse du mélanome de Dubreuilh en pré-chirurgical, d’orienter des zones de biopsie, de suivre l’efficacité d’un traitement dans le temps, de diagnostiquer les récidives. Elle permet aussi de guider des biopsies en cas de nécessité de confirmation diagnostique, en localisant les sites les plus rentables pour l’analyse histologique. Les limites de la microscopie confocale sont la moindre visualisation des lésions hyperkératosiques, et la génération d’images en noir et blanc, qui restent plus difficilement interprétables que l’histologie.
Différentes structures visualisées :
De la surface en profondeur, la couche cornée très reflétante et brillante est visualisée en premier. Elle est constituée de kératinocytes anucléés hyperreflétants polygonaux, et des lignes sombres entre les
65 îlots de cornéocytes représentent les dermatoglyphes. Ensuite, les couches granuleuse et spineuse contiennent des kératinocytes avec des noyaux ovales à ronds, entourés d’un cytoplasme brillant. Ces kératinocytes ont leurs contours cellulaires bien nets et sont arrangés en nids d’abeille réguliers formant un maillage régulier. La couche basale est composée d’une seule assise cellulaire représentée par des kératinocytes uniformes en taille et en forme, plus brillants que les kératinocytes des couches suprabasales en raison de la présence de mélanine dans leur cytoplasme. Chez les individus de phototype I, ces kératinocytes sont difficiles à mettre en évidence, par contre dans les phototypes II à VI, ils constituent un motif pavimenteux et sont hyperreflétants du fait de l’accumulation de mélanine supra nucléaire. Ces kératinocytes entourent des mélanocytes. La jonction dermo-épidermique (JDE) réalise des projections digitiformes dans l’épiderme, les papilles dermiques, qui sont représentées par des aires sombres contenant des capillaires et du collagènes, et qui sont dites marginées, c’est-à-dire délimitées par un anneau brillant correspondant aux kératinocytes basaux et mélanocytes qui contiennent le pigment. Ces papilles sont davantage visibles chez les individus aux phototypes élevés.
Le derme papillaire est composé d’un réseau de collagène formant un maillage réticulé, ou bien parfois organisé en faisceaux, et de structures fibrillaires modérément réfractives. Les vaisseaux sanguins apparaissent comme des structures tubulaires sombres, contenant des éléments cellulaires modérément réfractifs, ou bien au contraire très brillants (polynucléaires neutrophiles). Ils peuvent être visualisés grâce à leur flux sanguin. Le derme réticulaire est difficilement visualisé.
Également, la microscopie confocale permet la visualisation des parties supérieures des structures annexielles. La partie infundibulaire du follicule pileux apparaît comme un ostium bordé de débris de kératine reflétante, contenant souvent une tige pilaire centrale. Sous la kératine il y a des cellules de différentes tailles, constituant les différentes couches de l’épithélium infundibulaire. Les surfaces des glandes sébacées peuvent être visualisées sur le visage où elles sont en plus forte concentration, elles apparaissent brillantes du fait de la présence de gouttelettes lipidiques dans les cellules sébacées. Les canaux excréteurs des glandes sudorales eccrines sont également visualisés, à la différence de ceux des glandes apocrines.
Différentes cellules visualisées :
Les kératinocytes apparaissent comme des cellules cohésives polygonales, formant un motif en nid d’abeilles, avec un cytoplasme plus ou moins reflétant selon la densité en contenu de pigment. Les mélanocytes sont les cellules les plus reflétantes, rondes ou ovales, ou bien fusiformes avec des prolongations dendritiques. Elles sont isolées ou bien en nids dans l’épiderme ou le derme. Les mélanophages sont plus petits que les mélanocytes, sont riches en mélanine, peuvent avoir une forme irrégulière et pas de noyau visible. Les cellules pagétoïdes sont de grandes cellules nucléées avec un noyau foncé et un cytoplasme très brillant, correspondant à des mélanocytes atypiques ayant
66 ascensionné dans les couches supra-basales de l’épiderme. Elles sont observées par exemple dans les lentigos malins ou bien dans les mélanomes SSM. Les cellules de Langerhans sont très réfractives, dendritiques, et leur nombre est augmenté dans un environnement inflammatoire. Elles peuvent facilement être confondues avec des mélanocytes(81).
Description histologique et en microscopie confocale des principales lésions mélanocytaires:
Mélanome de Dubreuilh (ou Lentigo Malin)(83):
Histologiquement, le mélanome de Dubreuilh se caractérise par une prolifération jonctionnelle de mélanocytes atypiques sous forme de cellules isolées ou en petits nids, avec envahissement de la gaine des follicules pileux. Ces mélanocytes tumoraux ascensionnent dans les couches supra-basales de l’épiderme (diffusion pagétoïde). À cette prolifération tumorale, s’associent des signes de dommages actiniques : atrophie épidermique, aplatissement de la jonction dermo-épidermique et élastose solaire.
En microscopie confocale, il y a une perte de l’architecture normale épidermique avec disparition de l’aspect régulier en nid d’abeille. La présence de cellules pagétoïdes rondes de plus de 20𝜇m, atypiques, pléomorphes avec une disposition péri-folliculaire, est fortement évocatrice de mélanome de Dubreuilh. La présence de papilles non marginées (dont les bords ne sont pas bien limités et dont la structure est interrompue par des cellules reflétantes atypiques) à la JDE est fortement corrélée au diagnostic de mélanome de Dubreuilh. Dans les formes plus avancées, il existe un épaississement localisé de la JDE sous forme de cordons infiltrés par des cellules dendritiques atypiques qui partent souvent des follicules pileux (aspect caractéristique en tête de méduse).
Guitera et al. ont publié en 2010 un algorithme de diagnostic des lentigos malins, après avoir analysé plus de 300 lésions comprenant des lentigos malins et des lésions pigmentées bénignes. L’obtention d’un score ≥ 2 a une sensibilité de 93 % et une spécificité de 82 % pour le diagnostic du lentigo malin(84).
67 Figure 19 – Algorithme diagnostique des lentigos malins en microscopie confocale (Guitera et al., Journal of Investigative Dermatology, 2010)
Figure 20 – Mélanome de Dubreuilh : Aspects clinique, dermoscopique, en imagerie confocale et histologique (Le Duff et al., Annales de Dermatologie et de Vénéréologie, 2014)
68 Mélanome à Extension Superficielle (SSM)(81):
Le mélanome SSM est caractérisé en histologie par une lésion asymétrique, mal circonscrite, avec une phase de croissance horizontale intra-épidermique puis dermique superficielle, suivie d'une phase de croissance verticale. Il y a une migration pagétoïde des mélanocytes dans l’épiderme. Il peut exister un contingent dermique, qui ne présente pas l’organisation régulière d’un naevus. Les cellules sont pléomorphes et présentent de nombreuses mitoses.
En microscopie confocale, il y a une perte de l’architecture normale des couches superficielles de l’épiderme (perte du motif en nid d’abeille et du motif en pavé), la présence de cellules pagétoïdes rondes ou dendritiques dans les couches spineuse et granuleuse. À la JDE, les papilles sont non marginées, infiltrées par des cellules rondes ou dendritiques brillantes atypiques. La JDE est également épaissie par des amas cellulaires atypiques. Ces nids cellulaires jonctionnels ont une taille, une réflectance et une forme variables. Dans le derme papillaire, les nids mélanocytaires sont de forme irrégulière avec une hétérogénéité de réflectance. Dans le derme, il y a également des mélanophages dispersés.
Figure 21 - Mélanome in situ : aspect clinique, dermoscopique et en microscopie confocale (Carrera et al., Dermatologic Therapy, 2012)
69 Naevus mélanocytaire :
En histologie, un naevus correspond à hyperplasie circonscrite bénigne de mélanocytes dans la peau.
Il y a plusieurs groupes de lésions : les nævus dermiques où la prolifération mélanocytaire siège uniquement dans le derme, les nævus jonctionnels correspondent à la prolifération de mélanocytes au sein de la couche basale épidermique. Les thèques jonctionnelles sont situées dans la couche basale
Il y a plusieurs groupes de lésions : les nævus dermiques où la prolifération mélanocytaire siège uniquement dans le derme, les nævus jonctionnels correspondent à la prolifération de mélanocytes au sein de la couche basale épidermique. Les thèques jonctionnelles sont situées dans la couche basale