Analyse micromorphologique

L’analyse micromorphométrique est basée sur les caractères anatomique, caryologique et palynologique de quelques taxons. Les principaux caractères retenus sont la forme, la taille, la densité des poils et la forme, la taille et sculpture de l’exine des grains de pollen.

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Tableau 13 : Caractères utilisés dans l’analyse morphométrique des échantillons de Satureja récoltés et leurs codifications.

Organes

observés/mesurés Caractères observés ou mesurés Code

Quantitive Qualitative C a r a c t è r e s v é g é t a t i f s

Plante Port de la plante : dressée/ procombant/ décombant

PLDR/PLPR/PLDE +

Buissonnant/ fortement / faiblement / non ramifié PLBU/PLFR/PLWR/PLNR +

Souche Lignifiée/faiblement lignifiée/non lignifiée SOFL/SOWL/SONL +

Tige

longueur tige TILO +

largeur tige* TILA +

longueur entre nœud (2e et 3e verticillastre fleuris) ENLO +

Présence absence de poils tecteurs PTPR/PTAB +

Feuilles caulinaires

Longueur de la 3e feuille FCLO +

Largeur de la 3e feuille FCLA +

Feuilles révolutées/non révolutée (plate/ enroulée) FCPL/FCPE +

Longueur pétiole FCLP +

Marges des feuilles : dentées/ denticulées/crénelées/

lobées/ lisses FCDE/FCDT/FCCR/FCLB/FCLI

+ Nervation : pennée, réticulées, fortement ramifiée,

nervures IIaire absentes) NRPN/NRRE/NRFR/NRAB

+

C a r a c t è r e s f l o r a u x

Inflorescence (3e à

partir de la base

Nombre de fleur / verticillastre IFFR +

Longueur de l’inflorescence IFLO +

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Longueur bractéoles (feuilles florales) BLLO +

Largeur bractéoles BLLA +

Longueur bractées BTLO

Largeur bractée BTLA +

Longueur du pédoncule de l'inflorescence PILO +

Calice

fin de floraison avant fructification

longueur du pédicelle (fleur mediane) CPDL +

Longueur calice entier CALO +

Longueur du tube du calice CATL +

Diamètre mesuré à la base des dents (après incision du

calice entre les deux dents antérieures) CADC

+

Longueur dent supérieure (médiane) CADS +

Longueur dent inférieure CADI +

Nombre de stries CAST +

poils du carpostège (dense/faible / absent) CACD/CACF /CACA +

Corolle

couleur de la corolle (blanche, rose, rouge, violette) COBL/CORS/CORG/COVT/ +

Longueur du tube de la corolle CTLO +

Longueur corolle complète COLO +

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a/ Etude de l’indument

L’observation de l’indument est réalisée sur l’épiderme foliaire, et sur les calices. Pour chaque type de poil nous avons relevé la forme et la densité. Il y a plusieurs type de classification et terminologie pour l’étude de l’indument. Les plus utilisées sont celle de Roe (1971), Fahn (1988), Cantino (1990), Werker et al. (1993), Navarro et El Oualidi (2000) et Salmaki et al. (2009).

Les observations sont réalisées :

- Au microscope photonique (Paralux) : La structure des poils tecteurs et protecteurs est étudiée sur des coupes de tiges et de feuilles colorées au carmino-vert de Mirande.

- Au microscope électronique à balayage (MEB) qui permet de visualiser le relief des organes grâce à des images en 3 D.

La préparation du matériel végétal pour la MEB se fait en plusieurs étapes :

* Fixation du matériel : les organes prélevés sont placés sur des plots, fixés avec du scotch carbone et placés sur des porte-objets.

* Passage à vide : Ces organes sont placés dans un métalliseur, relié à une bonbonne de gaz (Argon). Sous vide, ils sont soumis au gaz sous dépression de 30 mA/ Pa. Durant cette phase, les tissus ou les cellules sont fixés et déshydratés. Le gaz permet de nettoyer les organes de tous les artefacts qui sont collés aux échantillons. Le passage sous vide se fait trois fois

* Métallisation : La métallisation permet de diriger les électrons pour mieux visualiser les échantillons. Elle se fait par une fine couche d’or (la métallisation peut se faire également avec une fine couche de carbone ou de platine) pendant 60 secondes sous une pression de 30mA/pa. Le métalliseur utilisé est un métalliseur Jeol FJC-1200 Fine coater.

* L’observation est faite à l’aide d’un microscope modèle type MEB Hitachi SU3500, grossissements en routine de 10 000 à 50 000, et sous certaines conditions jusqu’à 150 000 (figure 8).

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Figure 8 : Photographie du microscope électronique à balayage utilisé au MNHN Paris.

b/ Etude du pollen

Deux méthodes sont retenues pour cette analyse : la microscopie photonique et la MEB. L’observation des grains de pollen avec un microscope photonique se fait sans coloration avec un montage dans une goutte d’eau ou après coloration au carmin acétique. La coloration permet d’observer l’exine, le nombre, la forme et la position de l’aperture. Le montage se fait dans de l’eau glycérinée. La forme du pollen est déterminée par le rapport P/E, de la longueur de l’axe polaire (P) sur la longueur de l’axe équatorial (E) comme suit (Erdtman, 1986) :

- P/E ~1 le pollen est sphérique ;

- P/E > 1.2 le pollen est prolé ou longiaxe ; - P/E < 0.8 le pollen est oblé ou bréviaxe.

Les mesures sont réalisées cinq grains de pollen par taxon en utilisant le logiciel de traitement d’image Gimp (GPLv3). Les résultats sont exprimés en moyenne et en déviations standard. ( SE).

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c/ Analyse mitotique

Après germination des graines dans des boîtes de Pétri, recouvertes de papier filtre imbibé d’eau distillée, et placées à température ambiante, les méristèmes sont soumis à une série de traitements adapté de la méthode de Jahier et al. (1992).

- Prétraitement

Les racines sont plongées dans l’α-bromonaphtalène à 2°C pendant 20 heures. L’α- bromonaphtalène est une substance mitoclasique qui inhibe la formation du fuseau achromatique et par conséquent la migration des chromosomes vers les pôles. Il permet également la contraction des chromosomes.

- Fixation

Il existe un grand nombre de fixateurs dont l’acide acétique, le Carnoy I (Ethanol- Acétique 3 :1) et le Carnoy II (Ethanol-Chloroforme-Acide Acétique 6 :3 :1). Nos échantillons sont fixés pendant 24h dans le Carnoy I à 4°C pendant 24h. Le but de la fixation est d’empêcher toute activité cellulaire ultérieure en tuant les cellules sans les altérer. De plus, elle améliore le contraste entre les chromosomes et le fond cytoplasmique.

- Stockage

Cette étape peut être facultative mais elle permet d’ajourner les observations des chromosomes. Le conservateur utilisé est l’éthanol 70% à 4 °C pendant plusieurs jours.

- Hydrolyse acide

Cette étape permet de libérer les groupements aldéhydes des acides nucléiques ; ce qui a pour but de faciliter la coloration des chromosomes. De plus, elle permet le ramollissement des tissus et l’étalement des chromosomes. Elle se fait à l’acide chlorhydrique normal à 60 °C, pendant 5 minutes, dans le bain-Marie.

- Coloration

La coloration des chromosomes améliore leur visibilité et facilite la séparation des cellules. La coloration est faite au carmin acétique. Les méristèmes racinaires sont placés dans une goutte de carmin acétique sur une lame. On recouvre la lame d’une lamelle et on la chauffe légèrement au bec bunsen.

54 - Montage et écrasement

Le méristème racinaire est isolé sous la loupe et placé sur une lame. Le montage se fait dans une goutte de carmin acétique ou d’orcéine acétique. L’écrasement est fait par pression des méristèmes racinaires entre lame et lamelle. L’étalement des cellules se fait par l’application de petits coups à l’aide d’un bâtonnet. Les lames soigneusement étiquetées sont luttées et conservées au réfrigérateur jusqu’au moment de l’observation.

- Observation des lames et dénombrement chromosomique

Le dénombrement est effectué au stade métaphasique. Afin d’éviter toute ambiguïté, nous n’avons retenu que les cellules où les chromosomes sont bien individualisés.

Les observations sont faites à l’aide d’un microscope photonique Paralux équipé d’un appareil photographique. Les meilleures plaques métaphasiques sont sélectionnées et photographiées.

e/ Analyse méiotique

Les inflorescences sont récoltées avant l’anthèse et fixés in situ dans une solution de Carnoy I (Ethanol : Acide acétique, 3 :1). Afin de libérer les CMP, les anthères sont isolées et dilacérées sur une lame, dans une goutte de Carmin acétique.

Les lames sont ensuite passées sur une flamme de gaz bunsen ce qui permet de distendre les CMP. Le montage se fait dans une goutte d’acide acétique. L’observation se fait au microscope photonique Paralux au grossissement 40 puis au 100.

Les meilleures plaques sont photographiées à l’aide d’un appareil photo. Le comptage de chromosomes se fait sur des photos à l’aide du logiciel de traitement d’image Gimp version 2.8.10.

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