La MSP est une technique qui a été décrite pour la première fois en 1996 par Herman et ses collaborateurs (Herman et al., 1996). Pour réaliser cette réaction, trois facteurs doivent être considérés dans le choix des amorces. En premier lieu, l’ADN transformé par le bisulfite de sodium n’est plus auto-complémentaire. Les amorces choisies pour l’amplification de brins sens d’une partie définie de l’ADN seront donc différentes de celles qui sont utilisées pour les brins anti-sens. Deuxièmement, les amorces doivent contenir plusieurs cytosines qui ne font pas partie de dinucléotides CpG dans la séquence originale, et qui sont, donc, transformées en uraciles après le traitement. L’inclusion de ces bases dans les amorces aide à éviter l’amplification de l’ADN résiduel non transformé, et, donc, d’éviter les faux positifs. Troisièmement, les amorces doivent être choisies dans une région contenant plusieurs CpG dont une en 3’ pour garantir la spécificité méthylé/non méthylé.
Chapitre II
74 b- Protocole
Après plusieurs essais de mise au point, les conditions des réactions PCR sont les suivantes : la PCR a été réalisée dans un volume total de 25 μl contenant 2 μl d’ADN traité, du tampon PCR 1x (10 mM Tris-HCl ; 50 mM KCl ; 1,5 mM MgCl2 ; pH 8,3), 2,5 à 4 mM de
MgCl2, 0.4 mM de dNTPs, 0,2 µM de chaque amorce, 1 unité de Taq DNA polymérase
(Promega, France) et 5% de diméthyl sulfoxide (DMSO). L’amplification PCR a été réalisée dans un PTC 200™ DNA engine thermocycler (MJ Research, Watertown, USA). Les réactions d’amplifications ont été réalisées selon le programme suivant : une dénaturation initiale à 95°C pendant 5 minutes suivie de 35 cycles d’amplification comprenant une étape de dénaturation de 30 secondes à 95°C, une étape d’hybridation de 30 secondes à la température spécifique pour chaque gène analysé, une étape d’élongation de 30 secondes à 72°C, suivie d’une élongation finale à 72°C pendant 5 minutes. Les séquences des amorces utilisées dans ce travail avec les températures d’hybridation et la taille du produit PCR obtenu pour chaque gène sont résumées dans le Tableau II-10.
Pour chaque série d’amplification, de l’ADN universellement modifié/méthylé (CpG universal methylated 274 DNA ; Qbiogene, CA, USA) a été utilisé comme contrôle positif pour l’amplification des brins méthylés. Egalement, un contrôle négatif qui contient de l’eau distillée au lieu de l’ADN a été inclus afin de s’assurer de l’absence de contamination.
Chapitre II
75
Gènes Statut de
méthylation
Amorces Taille des produits
d’amplification (pb)
T°
d’hybridation Références
Sens (5’-3’) Anti-sens (5’-3’)
RASSFA1 M GTGTTAACGCGTTGCGTATC AACCCCGCGAACTAAAAACGA
94 56°C Burbee et al., 2001 U TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG CAAACCCCACAAACTAAAAACAA 108 58°C hMLH1 M ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC CCTCATCGTAACTACCCGCG 124 58°C Xu et al., 2004 U TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT ACCACCTCATCATAACTACCCACA 118 60°C BLU M
TTCGTGGGTTATAGTTCGAGAAAGCG AACGAATTAACCGCGCCTACGC 156 60°C Agathanggelou et al., 2003
U TTTGTGGGTTATAGTTTGAGAAAGTG AACAAATTAACCACACCTACAC 156 60°C
RAR-β M TCGAGAACGCGAGCGATTCG GACCAATCCAACCGAAACGA
146 57°C Widschwendter et al., 2000
U TTGAGAATGTGAGTGATTTGA AACCAATCCAACCAAAACAA 158 59°C APC M TATTGCGGAGTGCGGGTC TCGACGAACTCCCGACGA
98 58°C
Esteller et al., 2000 U GTGTTTTATTGTGGAGTGTGGGTT CCAATCAACAAACTCCCAACAA 151 60°C
ER M GTGTATTTGGATAGTAGTAAGTTCGTC CGTAAAAAAAACCGATCTAACCG 118 57°C Ottaviano et al., 1994 U GGTGTATTTGGATAGTAGTAAGTTTGT CCATAAAAAAAACCAATCTAACCA 120 58°C
P16 M
TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC GACCCCGAACCGCGACCGTAA 150 60°C
Herman et al., 1995 U TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT CAACCCCAAACCACAACCATAA 151 58°C
DAPK M GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC CCCTCCCAAACGCCGA
106 60°C
Toyooka et al., 2003 U GGAGGATAGTTGGATTGAGTTAATGTT CAAATCCCTCCCAAACACCAA 106 60°C
GSTP1 M TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC GCCCCAATACTAAATCACGACG 91 59°C Cairns et al., 2001
U GATGTTTGGGGTGTAGTGGTTGTT CCACCCCAATACTAAATCACAACA 97 59°C SHP1 M GAACGTTATTATAGTATAGCGTTC TCACGCATACGAACCCAAACG 159 56°C Oka et al., 2002 U GTGAATGTTATTATAGTATAGTGTTTGG TTCACACATACAAACCCAAACAAT 159 59°C Cyclin D2 M GGGTCGATCGTGTTGGCG ACATAAAACCTCCACGCTCG 124 59°C Evron et al., 2001 U GAAATATATTAAAGGGTGTG CCTAACCCAAACAACCAACC 147 59°C
HIN1 M GGTACGGGTTTTTTACGGTTCGTC AACTTCTTATACCCGATCCTCG 136 60°C Krop et al., 2001
Chapitre II
76 U GGTATGGGTTTTTTATGGTTTGTT CAAAACTTCTTATACCCAATCCTCA 136 60°C
CDH1 M TGTAGTTACGTATTTATTTTTAGTGGCGTC CGAATACGATCGAATCGAACCG 112 56°C Graff et al., 1995
U TGGTTGTAGTTATGTATTTATTTTTAGTGGTGTT ACACCAAATACAATCAAATCAAACCAAA 120 58°C BRCA1 M GGTTAATTTAGAGTTTCGAGAGACG TCAACGAACTCACGCCGCGCAATCG 86 59°C Esteller et al., 2000 U GGTTAATTTAGAGTTTTGAGAGATG TCAACAAACTCACACCACACAATCA 75 59°C TIMP3 M CGTTTCGTTATTTTTTGTTTTCGGTTTC CCGAAAACCCCGCCTCG 116 58°C Xu et al., 2004 U TTTTGTTTTGTTATTTTTTGTTTTTGGTTTT CCCCCAAAAACCCCACCTCA 119 59°C
Chapitre II
77
II.2.7. Analyses statistiques
La saisie des données clinico-pathologiques des patientes et les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide du logiciel SPSS version 13.0.
II.2.7.1. Association entre deux variables catégorielles
La recherche d'une association entre deux variables catégorielles, ce qui revient à comparer des proportions, a été évaluée au moyen du test du Chi-carré (2), ou du test exact de Fisher quand le nombre d'observations est trop petit (Schwartz, 1969 ; Falissard, 1996). Le seuil de signification statistique est fixé à la valeur de 5%. Donc, si la valeur de p est inférieure ou égale à la valeur de 0,05 choisie, cela signifie qu’il existe une corrélation statistiquement significative entre les deux variables.
II.2.7.2. Analyse d’association entre une variable catégorielle et une variable continue Les variables continues, suivant une distribution non normale dite non paramétrique ou non gaussienne, ont été comparées à l’aide du test de Mann-Whitney-Wilcoxon quand deux groupes distincts (indépendants ou non pairés) sont concernés et par l'analyse de variance selon Kruskall-Wallis lorsque plus de deux groupes sont considérés (Schwartz, 1969 ; Daurès, 1993). L'hypothèse nulle est l'absence de différence de distribution (médiane) entre les groupes alors que l'hypothèse alternative consiste en l'existence d'une différence de distribution (médiane) entre les groupes. Les variables continues, suivant une distribution normale dite paramétrique ou gaussienne, ont été comparées à l’aide du test t de Student pairé quand le même groupe est comparé à deux moments différents.
II.2.7.3. Analyse de la survie
Pour l’analyse des données de survie, la méthode de Kaplan-Meier est utilisée. Cette méthode de calcul permet d’établir des tables et des courbes de survie. Son objectif est d’estimer la probabilité de survie d’un groupe défini pour un intervalle de temps donné (Kaplan et Meier, 1958). La survie signifie que l’évènement observé (exemple décès ou rechute) n’est pas survenu au cours de l’intervalle de temps “t”. La durée de survie représente le laps de temps qui s’écoule jusqu’au moment où survient l’évènement ; en d’autres termes, le temps écoulé entre la date du début de l’étude et la date de survenue de l’évènement. La comparaison des durées de survie a été réalisée avec le test de log-rank (Peto et al., 1979).