Chapitre 2. MAP65-3, UNE PROTEINE ESSENTIELLE A LA FORMATION DES
II. Analyse fonctionnelle de MAP65-3
Le criblage de 20 000 lignées de la collection de l’INRA de Versailles a permis d’identifier environ 200 lignées qui présentent une expression du gène GUS au niveau des galles induites par M.
incognita. Parmi les lignées identifiées, la lignée DYC283 (Figure 11A) présente, après infection par M. incognita, une induction GUS au niveau des galles de façon précoce et durant toute la phase
d’ontogénèse des cellules géantes. L’analyse génétique et moléculaire réalisée a permis de montrer que cette lignée présentait une insertion d’un ADN-T dans le 5 ème exon du gène MAP65-3, qui code pour une protéine associée aux MT de la famille des MAP65 (Caillaud et al., 2008b).
Figure 12: Localisation subcellulaire de la protéine MAP65-3.
A: Profil d’expression de MAP65-3 observé sur des plantes transformées avec la fusion PMAP65-3:GFP
dans les cellules en division des méristèmes racinaires. Barres: 20 μm
B: Localisation de MAP65-3 (sur des plantes transformées avec la construction PMAP65-3:MAP65-
3:GFP)
C à K: Localisation de MAP65-3 avec tous les réseaux de microtubules au cours de la mitose
(GFP:MAP65-3 en vert et H2B:YFP en bleu). MAP65-3 localise avec les microtubules corticaux en G2 (C), avec la PPB (D et E), le fuseau mitotique en métaphase (F), le fuseau mitotique en anaphase (H) et
A
MAP65-3 au cours du développement de la plante.
La famille de MAP65 vé gétales correspond à l’homologue de ASE1p (« Anaphase Spindle Elongation Factor1 ») chez la levure (Schuyler et al., 2003) et PRC1 (« Protein Regulation Cytokinesis 1 ») chez les mammifèr es (Mollinari et al., 2002), qui sont impliquées dans la form ation du fuseau mitotique et la cytokinèse. Après l’ identification de 9 membres de la famille des MAP65 s. chez
Arabidopsis (Hussey et al., 2002), plusieurs équipes de recherche ont étudiés les propriétés
moléculaires et fonctionnelles de certains de ces membres. Des études biochimiques ont montrés que les MAP65 se lient aux MT in vitro grâce à un domaine conservé en C-t erminal (Smertenko et al., 2004) et induisent la formation de faisceaux de MT in vitro (Chang-Jie and S onobe, 1993; Wicker- Planquart et al., 2004). Les MAP65s diffèrent de part leurs activités, fonctions et liaisons aux MT. Ce sont des MAP non m otrices, qui participent à l ’organisation des réseaux de MT et la plupart des membres de cette famille se localise sur les réseaux de MT au cours de la mitose comme la PPB, le fuseau et le phragmoplaste (Van Damme et al., 2004; Hamada, 2007). MAP65-3/PLE a été isolée lors d’un criblage génétique de mutants de m orphogénèse de la raci ne chez Arabidopsis (Müller et al., 2002). Le mutant map65-3/ple présentait des défauts de cytokinèse au niveau du méristème racinaire, probablement du à une désorganisation du phragmoplaste (Müller et al., 2004).
o AtMAP65-3 est exprimée dans les tissus en division.
Au cours du développement de la plante, MAP65-3 est exprimé dans tous les t issus riches en cellules en division tel que les méristèmes caulinaires et racinaires, les primordia foliaires et racinaires, les jeunes feuilles et durant tous les stades de développement de l’embryon (Figure 11B). Ces résultats sont en accord avec les données d’ analyse du profil d’expression de gènes l ors du c ycle cellulaire montrant que MAP65-3 présente un pic d’expression lors de la transition G2/M (Menges et al., 2005). De plus, apr ès infection par M. incognita, le gène MAP65-3 présente une induction au niveau des galles (Figure 11A) de façon précoce et durant toute la phase d’ontogénèse des cellules géantes (i.e. de 48h à 3 semaines après i noculation). Cette période correspond à la phase où les cellules géantes subissent des divisions nucléaires. Lors de la phase de maturation des cellules géantes où il n’y a plus que de la croissance isotropique, MAP65-3 n’est plus exprimée dans les cellules géantes. Le gène reste cependant exprimé dans les cellules avoisinantes qui continuent à se diviser.
o MAP65-3 localise avec les réseaux de MT spécifiquement au cours de la
division.
La localisation subcellulaire de la protéine MA P65-3 a été réali sée sur des plantes mutantes KO, ici la lignée DYC283 homozygote) complémentées avec la fusion de MAP65-3 avec la GFP, sous le contrôle d e son pro pre promoteur (PMAP65-3:MAP65-3:GFP). Alors que le profil d’expression montrait une ind uction du promoteur dans to utes les cellules méristématiques, la protéine n’ est
Figure 13: Phénotype du mutant KO map65-3 au cours du développement de la plante. A: Phénotypes nains de la lignée mutant map65-3 , plantes âgées de 7 semaines (barre: 2cm). B: Coupe longitudinale de racines d’une plante sauvage.
C: Coupe longitudinale de racines de la lignée mutant map65-3 qui présente des cellules polynucléées et
hypertrophiées (étoile) et des parois avortées (flèche). (barre: 50 μm).
D: Une plante mutante map65-3 exprimant H2B:YFP (en bleu) et marquée à la sonde membranaire
FM4-64 (en rouge) présente un noyau aberrant, non divisé, s’enroulant autour d’une paroi avortée (flèche). (barre: 5 μm).
E: Image de microscopie électronique confirmant la présence d’un noyau non divisé (entouré de bleu)
s’enroulant autour d’une paroi avortée (flèche). (barre: 1 μm). D’après Caillaud et al.(2008b).
Sauvage Mutant Mutant nu nu Sauvage Mutant Mutant D E
détectée que dans les cellules en cours de division (Figure 12A et B). L’étude de la localisation de la protéine a permis de caractériser une distributi on cellulaire spécifique et de mettre en évidence un e régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle. Un marquage des MT a permis de montrer que MAP65-3 colocalise avec tous les ré seaux de MT au cours de la m itose tels que la bande préprophasique, le fuseau m itotique et le phragm oplaste (12C à K). Au cours de la c ytokinèse, MAP65-3 est localisée au centre du phragmoplaste puis au niveau de la plaque cellulaire en expansion (Caillaud et al., 2008b; Ho et al., 2011; Müller et al., 2004). La localisation de MAP65-3 suggère donc un rôle dans la division cellulaire et la cytokinèse.
o Le rôle de MAP65-3 au cours de la mitose.
Les plantes map65-3 homozygotes mutées pour ce gène présentent un phénotype m utant nain au niveau racinaire et aérie n (Figure 13A), et pr ésente des cellules plurinucléées ave c des parois incomplètes. Le m utant KO map65-3 présente un phénotype caractéristique de défauts lo rs de l a division cellulaire. En effet, ce mutant présente des cellules polynucléées et h ypertrophiées (Figure 13C). Certaines cellules présentent des noyaux anormaux, plus volumineux et non divisés (Figure 13D et E). Ces défauts pourraient résulter d’ aberrations lors de la ségrégation des chro mosomes en anaphase et de malformations du phragmoplaste. Ces anomalies résultent de défauts de l’ organisation des différents rése aux de MT au cours de la m itose visualisés à l’ aide du marqueur MAP4-GFP (Caillaud et al., 2008b). Le s études conjointes du phénotype cellulaire en absence de MAP65-3 ainsi que de localisation subcellulaire indiquent que cette MAP est impliquée dans l’organisation du fuseau mitotique dans la cellule v égétale (Figure 14A). Cependant, en absence de MAP65-3, les dé fauts lors de la for mation du fuseau mitotique ne sont pas observés systématiquement dans les c ellules en division. Une des hy pothèses pourrait être que MAP 65-3 ne serait indispensable à l’ organisation du fuseau mitotique qu’en cas de perturbations lors de la séparation des chromosomes.
L’analyse en temps réel du processus de cytokinèse en absence de MAP65-3 a permis de démontrer que les paro is avortées résultent de défauts lo rs de l’expansion du phragm oplaste (Figure 14B) (Caillaud et al., 2008b; Ho et al., 2011; Müll er et al., 2004). Chez le mutant map65-3, le phragmoplaste présente fr équemment une mauvaise localisation et lors de son expansion, dès qu’il touche un côté de la cellule, la fo rmation de la plaque cellulaire s’arrête : il en résulte une cytokinèse incomplète formant ces p arois avortées. Cette anomalie des MT du phrag moplaste serait donc à l’origine de l’ échec de la cy tokinèse et la pr ésence de cellules m ultinucléées chez le mutant KO
map65-3. Normalement, pour conserver l’intégrité d u phragmoplaste au cours de son expansion, la
cellule doit disposer de protéines ass ociées aux extrémités (+) des MT. Ch ez les métazoaires, les +TIPs régulent la dynamique à l’extrémité (+) des MT, jouant un rôle clé dans l’architecture cellulaire. Chez les pla ntes, à l’ heure actuelle, s eule une proté ine a été déc rite comme interagissant avec les extrémités (+) des MT. Il s’agit de l’h omologue chez A. thaliana de la « End Binding pr otein-1 »
Sauvage
mutant
Mutant
Sauvage
Mutant
défauts = 10%
Figure 14: Phénotype du mutant KO map65-3 au cours du développement de la plante.
A: Fuseaux mitotiques observés dans des cellules en division de plantes âgées de 7 jours sauvages et
mutantes KO map65-3. Le fuseau mitotique chez map65-3 présente des défauts d’organisation (10% des cas) résultant en une ségrégation anormale des chromosomes (flèche). Modèle proposé pour l’observation du phénotype du mutant map65-3.
B: Phragmoplastes observés dans des cellules en division de plantes âgées de 7 jours sauvages et
mutantes KO map65-3. Le phragmoplaste chez map65-3 présente des défauts lors de son expansion résultant en la formation de parois avortées. Modèle proposé pour l’observation du phénotype du mutant
map65-3 (barre: 5µm). Observation in vivo: les microtubules sont en vert (MBD-GFP) et les
chromosomes en bleu (H2B:YFP) et les membranes plasmiques en rouge (marquées au FM4-64). barre: 5µm. D’après Caillaud et al.(2008b).
A
(EB1) humaine (Chan et al., 2005). La localisation particulière de MAP65-3, concentrée au centre du phragmoplaste au cours de la cytokinèse en fait un très bon candidat pour être membre du complexe « +TIPs » chez A. thaliana.
MAP65-3 joue donc un r ôle clef dans l’or ganisation des réseaux de MT au cours de la mitose (morphogénèse du fuseau) et au cours de la cytokinèse (expansion du phragmoplaste) (Caillaud et al., 2008b ; Ho et al., 2011, 2012).
B
MAP65-3 dans l’interaction plante-nématode
o MAP65-3 est essentielle à l’ontogénèse des cellules géantes.
Un test d’infection par M. incognita réalisé sur les mutants KO map65-3 a permis de montrer que le nématode est capable de pénétrer et de m igrer à l’intérieur de la racine puis d’i nitier la redifférenciation des cellu les végétales en cellule s géantes (Figure 15 B et D). Cependant chez ce mutant les cellules géantes n’arrivent pas à maturation et dégénèrent (Figure 15 F), empêchant ainsi le développement du nématode qui meurt à un stade larvaire précoce (stade L3). L’absence de la protéine MAP65-3 conduirait à une accumulation d’anomalies au cours des mitoses successives, défauts qui conduisent à une dégénér escence du site nourricier. Les expériences de co mplémentation réalisées avec le gène MAP65-3 ont confirmé que MAP65-3 e st indispensable au développement de la cellule géante et du nématode (Caillaud et al., 2008b).
L’utilisation d’une lignée d’A. thaliana exprimant MBD-GFP, a permis de confirmer la présence de « mini » phragmoplastes synchrones dans les cel lules géantes en for mation (Figure 16B). La localisation subcellulaire de MAP65-3 in vivo dans les cellules géantes a montré que cette protéine est associée aux « mini » plaques cellulaires qui sépare nt, à la fin de la mitose, les noy aux dans les cellules géantes (Figure 16C et D).
o Modèle de formation des cellules géantes.
Dans les mutants map65-3, la cytokinèse est donc aussi initiée, mais l’accumulation de défauts (parois avortées, noyaux connectés) résultant d’anomalies de l’expansion du phragmoplaste, au cours des mitoses successives, conduirait à une dégénérescence du sit e nourricier et à la mort du nématode (Figure 17). Dans les cellules géantes, MAP65-3 est associée et régule les « mini » plaques cellulaires qui séparent les noyaux fils. Ainsi, bien que les cellules géantes résultent de divisions nucléaire s successives sans division cellulaire, Caillaud et al. (2008) ont pu dém ontrer que la cytokinèse y est initiée et indispensable à la formation de ces cellules géantes.
Figure 15: Phénotype du mutant KO map65-3 lors de l’interaction avec le nématode.
A et B: Noyaux (bleu) dans de jeunes cellules géantes (3jai, i.e. jours après inoculation) induites par M.
incognita. Chez le sauvage, la cellule géante (*) est binucléée (A). Chez le mutant map65-3 un seul
noyau est observé.
C et D: Coupes de galles à 10 jai. La cellule géante chez le sauvage (C) présente des structures
ressemblant à des fragments de parois, les minis plaques cellulaires (flèche). Des parois avortées inhabituelles sont observées chez le mutant map65-3 (D).
E et F: Coupes de galles à 21jai. La cellule géante chez le sauvage (C) est mature, et le nématode (N) a
effectué ses mues jusqu’au stade J4 (E). Chez le mutant map65-3, la cellule géante dégénère et le nématode meurt à un stade larvaire précoce J3 (F). Les coupes sont colorées au rouge de ruthénium (C et D) ou au bleu de toluidine (E et F), barre: 20µm (A à D) et 40µm (E et F). D’après Caillaud et al. (2008b).
3jai 10jai 21jai
Sa
uv
age
Figure 16: Cellules géantes en formation.
A: Observation in vivo au microscope confocal de cellules géantes (*) co-exprimant MBD-GFP (en vert)
et H2B-YFP (en rouge). Sept jours après infection les cellules géantes polynucléées présentent de larges faisceaux de microtubules corticaux. barre: 20µm
B: Observation de « mini » phragmoplastes synchrones dans les cellules géantes en formation in vivo
exprimant MBD-GFP (en vert) . barre: 10µm
C: Localisation de MAP65-3:GFP (vert) au niveau de « mini » plaques cellulaires (flèche rouge) dans les
cellules géantes à 14jai. barre: 20µm
D: Coupes de cellules géantes en formation à 10jai montrant les « mini » plaques cellulaires séparant les
noyaux fils barre: 10µm. D’après Caillaud et al.(2008b).
N
n n nn
NC
D
*
*
N N*
*
*
*
*
A
B
MBD:GFP
MAP65-3:GFP
Figure 17: Rôle de MAP65-3 durant l’ontogénèse des cellules géantes.
Chez le sauvage, dans les cellules géantes, la cytokinèse est initiée afin de permettre une barrière physique entre les deux noyaux fils. Mais la croissance de la plaque cellulaire est très vite bloquée permettant ainsi d’enchainer les mitoses suivantes et ainsi former la cellule géante polynucléée mature. Dans les mutants map65-3, la cytokinèse est aussi initiée, mais l’accumulation de défauts (parois avortées, noyaux connectés) au cours des mitoses successives, conduit à une dégénérescence du site nourricier et à la mort du nématode. D’après Caillaud et al.(2008b).
Sauvage Mutant map65-3 Cellule somatique Nouvelle paroi
Initiation Ontogénèse Maturité
Mini plaque cellulaire Successions de
mitoses
Cellule somatique
Initiation Ontogénèse Dégénérescence
Paroi avortée anormale Paroi avortée Successions de mitoses Défauts d’ontogénèse
C
Recherche de partenaires protéiques de MAP65-3.
Au vu du rôle clef de MAP65-3 au cours de la mitose et de la cytokinèse et le rôle essentiel qu’elle joue dans l’ontogenèse des cell ules géantes, mon laboratoire s’ est intéressé à se s potentiels interactants, dans le but de préciser son rôle et / ou sa régulation.
Afin d’identifier des partenaires protéiques de MAP65-3, une approche de double hy bride en levure a été initiée au laboratoire. L’utilisation de cette protéine comme appât et une banque d’ADNc de méristèmes d’A. thaliana comme proie a perm is d’identifier un premier interactant de MAP65-3. Cette protéine d’A. thaliana (At3g19590) présente une forte homologie avec les protéines BUB3 de la levure et de l’homme. Chez les animaux, la protéine BUB3 fait partie d’un complexe de surveillance de la mitose: le « Mitotic Checkpoint Com plex » (MCC), impliqué dans la surveillance de l’assemblage du fuseau : le « Spindle Assembly Checkpoint » ou SAC.
Figure 18: Les différents modèles d’attachements kinétochores / fuseau mitotique.
A: Le traditionnel modèle de « Recherche et capture »: un chromosome mono-orienté près d’un pôle
attendant d’être capturé par un microtubule émanant du pôle opposé. Le chromosome commence sa congression vers la plaque métaphasique (flèche unilatérale) grâce aux forces éjectrices de la fibre kinétochorienne (fibre-k) initiale et aux forces tractrices de la nouvelle fibre-k plus fine.
B: Le modèle « d’auto-assemblage » où les fibres kinétochoriennes peuvent être nucléées à proximité
des kinétochores. Ces fibres kinétochoriennes sont prises en charge par des protéines motrices (vers les extrémités -) permettant leurs incorporations dans le fuseau, et dirigeant leurs croissances vers les pôles. D’après Walczak et al.(2010).
Chromosome mono-orienté
Kinétochore Chromosome
Centrosome
fibre-k éjectrice fibre-k tractrice
Protéines motrices