Analyse de l’effet de l’acide valproïque au niveau moléculaire, sur la différenciation mégacaryocytaire des cellules Meg-01

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Après avoir montré que le VPA est capable d’induire la différenciation mégacaryocytaire au niveau cellulaire, nous avons analysé son effet au niveau moléculaire. Compte tenu des points de convergences entre l’érythropoïèse et la mégacaryopoïèse concernant les facteurs de régulation, nous nous sommes intéressés à l’effet du VPA sur les miR étudiés dans les modèles érythroïdes précédents.

Les cellules Meg-01 ont été traitées pendant 6, 24 et 72h avec 1 mM de VPA. Comme pour les cellules TF1 et K562, les résultats de PCR en temps réel montrent que l’expression des miR-144 et 451 diminue de façon significative lorsque les cellules sont traitées avec du VPA (Figure 52). L’expression du miR-27a, qui est impliquée positivement dans la voie de la mégacaryopoïèse, augmente de 3 fois dès 6h de traitement avec le VPA. Son niveau d’expression diminue cependant progressivement aux temps 24 et 72h. Concernant l’expression des miR-221 et 222, leur expression reste inchangée lors du traitement au VPA.

Pour compléter cette étude au niveau moléculaire, nous avons analysé l’effet du VPA sur l’expression de certains facteurs de transcription impliqués dans la régulation de la mégacaryopoïèse. Nous avons observé par western blot (Figure 53B), que le VPA est capable de diminuer l’expression du facteur GATA-1 dans les cellules Meg-01 en accord avec la diminution de l’expression des miR-144 et 451. Au contraire, l’expression de GATA-2 est augmentée, en accord avec l’induction de la mégacaryopoïèse, puisque ce facteur est nécessaire pour l’orientation des CSH dans cette voie. D’autre part, nous avons analysé par PCR en temps réel l’effet du VPA sur l’expression de l’ARNm du facteur de transcription RUNX1, impliqué dans la régulation de la mégacaryopoïèse. Les résultats montrent une diminution de l’expression de l’ARNm de RUNX1 dès 6h de traitement au VPA, en accord avec l’activation de la mégacaryopoïèse et l’augmentation du miR-27a (Figure 53A). !

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Figure 52 : Effet du VPA sur l’expression des miR impliqués dans la régulation de la mégacaryopoïèse

Les cellules Meg-01 ont été traitées avec 1 mM de VPA pendant 6, 24 et 72h. Les ARN totaux ont été extraits et analysés par PCR en temps réel pour l’expression des miR-221, 222, 144, 451 et 27a. Les résultats ont été normalisés par rapport au gène de ménage RNU1A et calculés par la méthode du ""Ct. Les résultats représentent la moyenne ± la déviation standard à la moyenne de 3 expériences indépendantes. **p < 0,01 et *p < 0,05. ! 0 1 2 3 4 221 222 144 451 27a 2 -!! ct 6h 24h 72h * * * * ** miR * *

Figure 53 : Effet du VPA sur l’expression des facteurs de transcription impliqués dans la régulation de la mégacaryopoïèse

Les cellules Meg-01 ont été traitées avec 1 mM de VPA pendant 6, 24 et 72h.

A. Les ARN totaux ont été extraits et analysés par PCR en temps réel pour l’expression de l’ARNm de RUNX1. Les résultats ont été normalisés par rapport au gène de ménage actine-$ et calculés par la méthode du ""Ct.

B. L’expression de GATA-1 et GATA-2 a été analysée par western blot à partir d’extraits nucléaires. L’actine-$ est utilisée comme contrôle de chargement. Les western blots représentent chacun une expérience parmi 3. Le graphe sous le western blot correspond aux quantifications de GATA-1 et GATA-2. Les valeurs obtenues sont normalisées par rapport au contrôle (C).

Les valeurs des quantifications représentent la moyenne ± la déviation standard à la moyenne de 3 expériences indépendantes. **p < 0,01 et *p < 0,05.

C V 6h C V 24h C V 72h GATA-2 GATA-1 Actine-!" Actine-!" A B 0.5 0.7 0.9 1.1 6h 24h 72h 2 -## ct ** ** RUNX1 0 1 2 6h 24h 72h Q u a n ti fi ca ti o n (R a ti o ) GATA-1 GATA-2 ** ^** ** ** *

L’ensemble des résultats montre que le VPA est capable d’inhiber la différenciation érythroïde et d’induire la différenciation mégacaryocytaire. Nous nous sommes donc intéressés à la capacité du VPA de provoquer une transition entre la voie érythroïde qui est inhibée et la voie mégacaryocytaire qui est induite, en modulant l’expression de facteurs de transcription impliqués dans les deux voies mais de manière contradictoire. Ainsi, outre le facteur PU.1 déjà étudié plus haut, les facteurs de la famille ETS, ETS-1, Fli-1 et GABP-#, qui favorisent la voie mégacaryocytaire tout

en inhibant la voie érythroïde ont été analysés. Nous avons traité les cellules CD34⁺

avec 10 U/mL d’Epo et 1 mM de VPA pendant 4 jours et nous avons analysé l’expression de ces facteurs de transcription. De façon intéressante, l’expression des trois facteurs de transcription est clairement et significativement augmentée, ce qui est en accord avec l’activation potentielle du développement mégacaryocytaire. En revanche, les résultats de western blot indiquent que l’expression du facteur de transcription RUNX1 n’est pas modifiée dans ces conditions (Figure 54).

En conclusion, les résultats montrent l’effet spécifique du VPA sur les miR et les facteurs de transcription impliqués dans la mégacaryopoïèse. La diminution de l’expression de GATA-1 et des miR-144/451 n’entraîne pas d’inhibition de la voie mégacaryocytaire et semble donc être plus spécifiques de la voie érythroïde. L’augmentation de l’expression de GATA-2 est en accord avec l’induction de la voie mégacaryocytaire. L’induction de l’expression du miR-27a est en lien avec la diminution de l’expression de l’ARNm du facteur de transcription RUNX1.

De plus, l’utilisation des CSH induites avec de l’Epo et traitées avec du VPA a permis de mettre en évidence que le VPA module l’expression de facteurs de transcription communs aux voies de différenciation érythroïde et mégacaryocytaire, notamment les facteurs de la famille ETS et de la famille GATA.

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Figure 54 : Expression des facteurs de transcription impliqués dans la régulation

de la mégacaryopoïèse dans les cellules CD34⁺

Les cellules CD34⁺ ont été stimulées avec de l’Epo et traitées ou non avec 1 mM de

VPA pendant 4 jours.

L’expression des différents facteurs de transcription a été analysée par western blot à partir d’extraits protéiques nucléaires. L’actine-$ est utilisée comme contrôle de chargement. Les western blots correspondent chacun à une expérience représentative parmi 3. Le graphe à côté du western blot correspond aux quantifications des différents western blots. Les valeurs obtenues sont normalisées par rapport au contrôle (C).

Les valeurs des quantifications représentent la moyenne ± la déviation standard à la moyenne de 3 expériences indépendantes. **p < 0,01 et *p < 0,05.

Fli-1 Epo Epo/ VPA ETS-1 RUNX1 GABP-!" Actine-#" 0 1 2 3 4 Fli-1 ETS-1 RUNX1 GABP-! Quantification (Ratio) * * * Actine-#" Actine-#" Actine-#"

5 Discussion

Le VPA est utilisé depuis 1967 comme médicament antiépileptique et psychotrope. Plus récemment, il a été décrit comme un inhibiteur des histones désacétylases (HDAC), conférant à cette molécule un intérêt en thérapie anti-cancéreuse. Son utilisation en neuropsychiatrie a permis d’obtenir de nombreuses données cliniques concernant ses effets secondaires (Chateauvieux et al. 2010). Notamment, le rôle du VPA dans les troubles hématologiques est en corrélation avec sa toxicité directe sur la moelle osseuse, entraînant ainsi des thrombocytopénies, des dysfonctionnements plaquettaires, des anémies aplasiques, des coagulopathies, des hypofibrinogénémies, des déficiences du facteur XIII de coagulation et la maladie de Von Willebrand. Des travaux antérieurs réalisés au laboratoire ont démontré la capacité du VPA de bloquer le processus de différenciation érythrocytaire, induit par des agents différenciants dans les cellules leucémiques (Chateauvieux et al. 2011). Basé sur ces résultats, nous démontrons ici que le VPA, qui possède une activité inhibitrice des HDAC principalement de classe I (Gottlicher 2004; Gurvich et al. 2004), est capable de moduler la différenciation érythroïde, tout en favorisant les caractéristiques mégacaryocytaires. Cette modulation passe par la modification de l’expression des facteurs de transcription et de miR impliqués dans la régulation de l’hématopoïèse, mais se révèle étrangère à l’activité inhibitrice des HDAC.