Séparation des oligomères par filtration tangentielle
5. Méthodes analytiques
5.3. Analyse des flavonoïdes et de leurs oligomères par spectrométrie de masse
5.3.1. Principe général de l’analyse par spectrométrie de masse
La spectrométrie de masse permet de mesurer avec précision la masse d’une molécule selon son rapport masse/charge (m/z). Cette analyse consiste en trois étapes, une étape d’ionisation, une étape d’accélération et une étape de détection. Un spectromètre de masse est composé d’un système d’introduction de l’échantillon, d’une source d’ions, d’un analyseur qui séparent les ions selon leur m/z et d’un détecteur.
• Le système d’introduction de l’échantillon : l’échantillon peut être introduit directement dans la source, sous forme liquide (infusion directe, couplage à un système chromatographique, …) ou solide (canne d’introduction directe, dépôt sur plaque, ...).
• La source d'ionisation : elle consiste à vaporiser les molécules et à les ioniser. La source d’ion peut être utilisée en mode positif (M + H+) ou négatif (M – H-). Si l’échantillon présente des groupements fonctionnels accepteurs d'H+, le mode positif est choisi (amine sur protéine ou peptides), à l’inverse si les groupements sont donneurs de protons, le mode négatif est retenu (acide carboxylique, groupements alcools sur les sucres, oligonucléotides). Plusieurs types de sources existent et sont utilisées en fonction du résultat recherché et des molécules analysées. Citons par exemple, l’ionisation électronique, l’ionisation chimique, l’ionisation chimique à pression atmosphérique
2. Matériels et protocole
L’analyse infrarouge a été effectuée avec un cristal à réflexion totale atténuée (ATR) sur un spectromètre à transformée de Fourier (FTIR) Tensor 2
noï es ou d’oligomères dans un le mélange méthanol/eau sta ATR puis évaporées sous vide à 50 °C. D
effectués afin de concentrer l’échantillon. Le film obtenu est alors an
obtenus par l’accumulation de 1024 scans avec une résolution de 2 cm-1. Le traitement des spectres a consisté en une correction des bandes H2O/CO2, un lissage de Savitzky-Golay à
(APCI), l’électrospray (ESI) ou encore l’ionisation-desorption laser assistée par matrice (MALDI).
• L’analyseur et de séparer les ions en f e rt m arge
(m/z), citons par exemple : le quadripôle, le piège à ions ou encore le temps de vol (TOF).
Aux vues des travaux précé ant l’analyse de polymères de flavonoïdes
an us nous so rticu èrement intéressés au MALDI couplé
r TOF.
Principe de l’ionisation de type MALDI
Le MALDI, pour Matrix As ser Desorption Ionisation, est une technique
n par dés s atrice. Ce mode d’ionisation provoque très
peu de fragmentations, et est donc bien adapté à l’analyse des mac les. Le composé à étudier est d’abord incorporé dans une matrice org ue généralement cristallisée. Ce
isation
ainsi s
molécules (M<500 Da) sont difficiles à étudier du fait de la présence des ions produits par la
décom ’autres supports à base de silicium poreux par
exem our remplacer les matrices traditionnelles [187].
: perm onction d leur rappo asse/ch
dents abord
(tannins, anthocy es), no mmes plus pa li
à l’analyseu
5.3.2.
sisted La
d’ionisatio orption laser as istée par une m
romolécu aniq
mélange est déposé sur un support et placé dans le spectromètre au point d’impact d’un faisceau laser pulsé. Au point d’impact, l’énergie reçue est transférée par la matrice au
omposé qui se trouve à la fois désorbé et ionisé de façon douce (Figure II.8.). L’ion c
que la détection sont réalisées sous un vide poussé (-106 à -108 atm). Les petite
position de la matrice. Pour ces études, d ple sont maintenant utilisés p
Figure II.8. Représentation schématique de la désorption laser [187].
Le succès de la méthode MALDI dépend en grande partie du choix de la matrice et de la préparation de l’échantillon. Le rôle de la matrice consiste en :
l’incorporation de la molécule par co-cristallisation l’absorption de l’énergie du rayonnement
la mise en phase gazeuse de la molécule par codésorption [188].
Différentes matrices ont été utilisées dans le cadre de l’analyse des flavonoïdes, certaines d’entre elles sont répertoriées dans le Tableau II.4..
Tablea tilisées dans le cadre de l’analyse de flavonoïdes par MALDI-TOF.
Molécules
u II.4. Matrices u
Matrice Mode de dépôt Cation Détection
(ionisation)
Référence
Proanthocyanidine DHB Dried-droplet Iodide de
sodium
TOF (+) [189]
Tannins DHB Dried-droplet NaCl TOF (+) [190]
puis analyte TOF (+) [191] Polygalloyl polyflavan-3-ols [192] ligomères atéchiques IAA, DHB, CCA, SA, Dried-droplet Sel d’argent TOF (+) [193]
Procyanidins plet Sel
d’argent TOF [194] Tannins DHB Matrice/polymère /matrice Na+ TOF (+) [195] Flavonol glycosides HCCA, THAP, IDA, HABA, DHB
Dried-droplet NaCl TOF + ou -, le
+ étant favorable [196] Rutine DHB LiCl ou KCl TOF + [197] Flavonol glycosides THAP Dépôt matrice/séchage NaCl
t-IAA Dried-droplet TOF (+)
O c HABA, dithranol, 9NA, 5SCA IAA Dried-dro Dried-droplet
HCCA: 4-hydroxy-R-cyanocinnamic acid ; THAP:2’,4’,6’-trihydroxyacetophenone monohydrate ; HABA: 2-(4-hydroxyphenylazo)benzoic acid ; IDA: trans-3-indoleacrylic acid ; DHB: 2,5-dihy
chlo
La qualité du spectre dépend de certains facteurs liés à la préparation de l’échantillon :
réparation des cristaux,
la sélection et la nature de la matrice,
ment:
droxybenzoic acid ; IAA: trans-3-indoleacrylic acid ; 9NA: 9-nitroanthracene ; 5SCA: 5-rosalycilic acid ; SA: sinapinic acid ; HABA : matrice la plus appropriée selon les auteurs
la méthode de p
la présence de tampons, le pH des solutions,
les caractéristiques intrinsèques de la molécule d’analyte, le ou les solvants utilisés,
la pureté de l’échantillon (présence de polymères synthétiques, plastiques, sels). Différents modes de dépôts sont envisageables [214, 215] notam
« dried droplet method » : La solution d’analyte est mélangée à la matrice en concentration beaucoup plus élevée dans le même solvant. Le ratio matrice/analyte varie de 100 à 10 000 dépendant de la chimie et de la masse du polymère. 1 µl de cette solution est placé sur la cible du MALDI puis séché.
« layer ce à saturation ou à forte concentration est d’abord déposée sur la cible puis séchée, l’échantillon est alors déposé.
masses différentes seront séparés, dans un tube, selon leur temps de vol. L’ensemble du tube est placé sous un vide poussé. Les ions légers sont détectés les premiers, les ions les plus lourds parviennent au détecteur après un certain délai qui dépend de leur masse.
Le mode de détection peut être linéaire ou par réflectron (Figure II.9.). Le mode linéaire permet l’analyse de haute masse moléculaire allant au-delà de 1 000 000 Da. Dans le cas du réflectron, le miroir électrostatique permet d’allonger la distance de vol sans augmenter la taille de l’instrument. Le détecteur du réflectron est placé sur le plan de focalisation des ions de même rapport m/z.. Le réflectron corrige la dispersion en énergie cinétique, mais il ne corrige pas la dispersion en temps. Il permet d’augmenter la résolution, mais il est limité à des
masses in 0
» méthode, la solution de matri
5.3.3. Principe de l’analyseur par temps de vol
L’analyse en temps de vol (TOF) est bien adaptée à la nature pulsée de la désorption MALDI. À une énergie cinétique donnée, la vitesse v d’un ion est inversement proportionnelle à la racine carrée de sa masse moléculaire :
qV = mv2 / 2, d’où v = [(2qV)/m] ½ avec q= ze, z nombre de charges de l’ion, V potentiel d’accélération de l’ion, m masse moléculaire de l’ion.
Après accélération, des ions de
férieures à 6 0 0 Da.
Figure II.9. Représentation schématique de l’analyseur par temps de vol en mode réflectron [187].
5.3.4. Protocole
La préparation de l’échantillon ainsi que de la matrice et le dépôt sur cible MALDI sont réalisés automatiquement sur la plateforme Chemspeed. L’ensemble de l’analyse par MALDI-TOF a été optimisé et fera l’objet d’un paragraphe ultérieur dans la partie résultats.
Au cours de cette mise au point, trois matrices ont été testées :
Tableau II.5. Matrices utilisées dans l’analyse MALDI-TOF.
Nom (abréviation) Structure
Acide 2,5-dihydroxybenzoique (DHB) OH O H COOH 2,4’,6’-trihydroxyacetophenone (THAP) HO OH OH O
Acide sinapinique (SA) CH3O COOH
O H
OMe