Analyse des facteurs de virulence potentiels

Introduction

L’identification des facteurs de virulence a été réalisée par Caroline Anselme, à l’époque post-doctorante à l’INRA de Sophia-Antipolis dans l’UMR IBSV dirigée par Marylène Poirié. Une banque d’ADN complémentaires des glandes à venin d’A ervi a été séquencée dans le cadre d’un projet Génoscope. Les facteurs de virulence potentiels ont été identifiés sur la base des similarités de séquences ou de fonctions à des facteurs déjà décrits et/ou selon l’abondance des transcrits dans la banque. La confirmation de leur surexpression dans les glandes à venin (par rapport au reste du corps) a été réalisée par RT-PCR quantitative. Neuf gènes candidats, dont deux gènes γGT ont été identifiés. Les protéines identifiées auraient des fonctions liées à la castration de l’hôte (γGT) et à l’inhibition du système immunitaire du puceron (autres candidats).

Méthodes

Pou déterminer si la sélection vis-à-vis de la résistance du puceron hôte a un effet au niveau de l’expression des facteurs de virulence des parasitoïdes, nous avons quantifié le taux de transcrits des différents gènes chez les femelles parasitoïdes exposées ou non à la résistance conférée par H. defensa. Pour cela, les glandes et le réservoir à venin des femelles ont été disséqués (Figure 4.2.) et l'ARN a été extrait avec le kit RNeasy Plus Micro Kit de Qiagen. Les ARNm ont été rétrotranscrits avec le kit iScript cDNA Synthesis (BioRad). La quantification par PCR quantitative en temps réel a été réalisée avec le système Opticon monitor 2 de BioRad grâce au kit qPCR SYBR MasterMix Plus for SYBR Green I No ROX d'Eurogentec, à l’INRA de Sophia-Antipolis. Des amorces spécifiques des gènes d’intérêt et les conditions optimales de PCR ont été déterminées pour chaque candidat ainsi que pour deux gènes de ménage (RPL19 et RPL23) utilisés pour normaliser les données. Les résultats ont été analysés par la méthode des delta CT à l'aide du logiciel qBase (Hellemans et al., 2007).

A l’issue d’une analyse préliminaire sur des échantillons correspondant aux femelles avant l’évolution expérimentale (G₀), et aux femelles des 10^ème et 11^ème générations exposées ou non à la résistance conférée par le symbiote, trois gènes qui présentaient une variabilité du taux de transcrits ont été sélectionnés pour notre étude. Il s’agit de gènes codant pour un peptide riche en cystéines nommé ‘CL11C1’ (rôles potentiels : peptide

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antimicrobien ou inhibiteur de la mélanisation), et deux protéases à sérine, ‘CL7C1’ et ‘YL16’ (inhibiteurs potentiels de la mélanisation).

Nous avons analysé la quantité de transcrits de ces trois gènes dans les glandes des femelles avant à G₀, à G₂₅ (après 25 générations de parasitoïdes exposés ou non à H. defensa), et sur des femelles d’élevage n’ayant subi aucune manipulation durant les 25 générations.

Figure 4. 2. : Etapes de la dissection des femelles parasitoïdes. L’appareil reproducteur est d’abord extrait sous loupe binoculaire dans du liquide physiologique de Ringer (1et 2), pour ensuite en isoler le réservoir et la glande à venin (3). Réservoir (a), glandes à venin plurilobées (b), ovaires (c), spermathèque (d),

glande de Dufour (e) et ganglion de la chaîne nerveuse (f).

Résultats

La quantité de transcrits de CL11C1 est beaucoup plus importante dans les glandes des femelles expérimentées de la G25 que dans les glandes des femelles des populations d’élevage ou de celles prélevées avant l’évolution expérimentale (G₀). Le taux de transcrits de CL7C1 est en revanche plus faible en G₂₅ dans les deux lignées de femelles par rapport à la G0. Enfin, le taux de transcrits de YL16 est plus faible chez les femelles expérimentées de la G25. Il n’y a pas de différence significative entre les taux de transcrits de CL11C1 et CL7C1 des femelles exposées et des femelles non exposées au symbiote (Figure 4.3.).

Discussion et conclusion

CL11C1 est le seul gène surexprimé à la 25^ème génération de sélection par rapport à la G0. Toutefois, il n’y a pas de différence significative entre les deux traitements, parasitoïdes exposés ou non à H.defensa.

97 CL11C1 CL7C1 YL16 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 T a u x d e t ra n s c ri ts (e x p re s s io n r e la ti v e )

Avant Evolution Expérimentale Population en élevage (G₂₅)

Parasitoïdes non exposés à H. defensa (G₂₅)

Parasitoïdes exposés à H. defensa (G₂₅) Avant Evolution Expérimentale

Population en élevage (G₂₅)

Parasitoïdes non exposés à H. defensa (G₂₅)

Parasitoïdes exposés à H. defensa (G₂₅) a a b b a b c c a b a a

Figure 4.3. Expression relative de CLC11, CLC7 et YL16. Les taux de transcrits relatifs sont calculés par rapport au taux de transcrits chez les femelles de la génération 0 (avant sélection expérimentale) choisies comme échantillon de référence (taux de transcrit fixé à 1). Les barres verticales représentent l’erreur standard

de la moyenne calculée à partir de trois répétitions biologiques et trois répétitions techniques. Les lettres différentes indiquent des taux d’expression significativement différents à p<0,05.

Le facteur de cette sélection reste donc inconnu, mais plusieurs hypothèses peuvent être formulées :

i. Les femelles issues de l’élevage ont été prélevées directement dans la cage alors que les femelles expérimentées ont subi plus de manipulations (prélèvement, isolement). L’expression de CL11C1 pourrait donc être associée à un stress des femelles dû à cette manipulation.

ii. Les pucerons possèdent une réponse intrinsèque, qu’ils portent ou non le symbiote. CL11C1 pourrait donc jouer un rôle dans le contournement du système immunitaire de l’hôte.

iii. Au cours de cette expérience, les femelles parasitoïdes sont aussi sélectionnées sur des caractères liés au succès parasitaire, comme la capacité à exploiter leurs hôtes (ex.

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via castration). Il est donc possible que CL11C1 puisse influer sur l’exploitation des ressources de l’hôte.

Aucun gène n’étant surexprimé spécifiquement chez les femelles sélectionnées sur les pucerons très résistants, nos résultats n’ont pas permis d’identifier de facteurs de virulence sélectionnés lors de l’exposition aux pucerons porteurs de H. defensa. Des analyses moléculaires supplémentaires et des comparaisons avec des facteurs présents chez une espèce de parasitoïde proche d’A. ervi permettront de préciser les fonctions exactes de ces molécules dans l’exploitation de l’hôte.