IV. LOCALISATION SUBCELLULAIRE DE LA PROTEINE
4. Analyse des données de localisation subcellulaire
a. Localisation des fibrilles matures Pmel17 avec les enzymes de la
famille des tyrosinases
Les résultats du marquage individuel des enzymes Tyr, Tyrp1 et Tyrp2 obtenus par immunofluorescence sont similaires à ceux des analyses de détection de ces trois enzymes par western blotting. En effet, les protéines Tyr et Tyrp2 révèlent un marquage positif aussi bien sur les coupes de peaux Charolaise que Prim’Holstein, alors que Tyrp1 est détectée uniquement sur les coupes de peaux Prim’Holstein. Ainsi, l’absence de détection de la protéine Tyrp1 sur les coupes de peaux Charolaise, confirme la sous-expression constatée pour cette dernière, au sein du profil western blotting des échantillons Charolais.
Les analyses des résultats de marquage avec l’anticorps HMB45 couplé à l’Alexa fluor 488 (vert) et les anticorps spécifiques des enzymes Tyr (Figure 48), Tyrp1 (Figure 49) et Tyrp2 (Figure 50) couplés à l’Alexa fluor 596 (rouge) montrent une co-localisation uniquement de la protéine Pmel17 sauvage avec ces trois enzymes. Cette co-localisation correspond à la fluorescence jaune observée dans les espaces séparant les noyaux des cellules, marqués au DAPI (bleu). Sur les coupes de peaux sauvages, les profils de co-localisation de Pmel17 avec les protéines Tyr, Tyrp1 et Tyrp2 sont similaires. Toutefois, le signal de co-localisation de la protéine Pmel17 sauvage avec la protéine Tyrp2 est plus faible comparé à ceux des deux autres protéines. La fluorescence jaune caractéristique de cette co-localisation est observée majoritairement au niveau des mélanocytes folliculaires, celle-ci s’étend du noyau d’une cellule jusqu’aux noyaux des cellules avoisinantes, caractéristique de la localisation cytoplasmique des mélanosomes.
L’analyse des coupes de peaux Charolaise montre une absence de marquage de la protéine Pmel17 avec l’anticorps HMB45. Ce résultat est concordant avec les analyses western blotting indiquant l’absence de fibrilles Pmel17 spécifiques du mélanosome de stade II au sein des échantillons protéiques de peaux Charolaise.
Figure 49 : Localisation des fibrilles Pmel17 avec la protéine Tyrp1 par microscopie confocale. Le profil de réactivité des anticorps est examiné par un triple marquage. Les noyaux des cellules sont marqués en bleu (DAPI), l’anticorps HMB45 (dilution 1/10) reconnaissant les fibrilles Pmel17 est détecté par la fluorescence verte, l’anticorps anti-Tyrp1 (dilution 1/50) reconnaissant la protéine Tyrp1 est détecté par la fluorescence rouge. La fluorescence jaune spécifique de la co-localisation des deux signaux est indiquée par des flèches. Les astérisques (*) indiquent les emplacements des follicules pileux.
Figure 50 : Localisation des fibrilles Pmel17 avec la protéine Tyrp2 par microscopie confocale. Le profil de réactivité des anticorps est examiné par un triple marquage. Les noyaux des cellules sont marqués en bleu (DAPI), l’anticorps HMB45 (dilution 1/10) reconnaissant les fibrilles Pmel17 est détecté par la fluorescence verte, l’anticorps αPEP8h (dilution 1/10) reconnaissant la protéine Tyrp2 est détecté par la fluorescence rouge. La fluorescence jaune spécifique de la co-localisation des deux signaux est indiquée par des flèches. Les astérisques (*) indiquent les emplacements des follicules pileux.
Figure 51 : Localisation des formes précoces de Pmel17 avec la protéine Tyr par microscopie confocale. Le profil de réactivité des anticorps est examiné par un triple marquage. Les noyaux des cellules sont marqués en bleu (DAPI), l’anticorps GP100 (dilution 1/20) reconnaissant Pmel17 est détecté par la fluorescence verte, l’anticorps αPEP7h (dilution 1/10) reconnaissant la protéine Tyr est détecté par la fluorescence rouge. La fluorescence jaune spécifique de la co-localisation des deux signaux est indiquée par des flèches. Les astérisques (*) indiquent les emplacements des follicules pileux.
b. Localisation des formes précoces de Pmel17 avec les enzymes
Tyr et Tyrp2
Les analyses des résultats de marquage avec l’anticorps GP100 couplé à l’Alexa fluor 488 (vert) et les anticorps spécifiques des enzymes Tyr (Figure 51) et Tyrp2 (Figure 52) couplés à l’Alexa fluor 596 (rouge) montrent une très faible co-localisation des protéines sauvages et mutantes avec les protéines Tyr et Tyrp2. Le signal de co-localisation est observé au niveau des mélanocytes folliculaires et se restreint à la périphérie d’un nombre peu élevé de noyaux. Le profil de co-localisation périnucléaire des protéines Tyr et Tyrp2 avec la protéine Pmel17 est spécifique des compartiments précoces de la voie de biosynthèse de ces protéines.
Figure 52 : Localisation des formes précoces de Pmel17 avec la protéine Tyrp2 par microscopie confocale. Le profil de réactivité des anticorps est examiné par un triple marquage. Les noyaux des cellules sont marqués en bleu (DAPI), l’anticorps GP100 (dilution 1/20) reconnaissant Pmel17 est détecté par la fluorescence verte, l’anticorps αPEP8h (dilution 1/10) reconnaissant la protéine Tyrp2 est détecté par la fluorescence rouge. La fluorescence jaune spécifique de la co-localisation des deux signaux est indiquée par des flèches. Les astérisques (*) indiquent les emplacements des follicules pileux.
Figure 53 : Localisation de la protéine Pmel17 dans le RE par microscopie confocale. Le profil de réactivité des anticorps est examiné par un triple marquage. Les noyaux des cellules sont marqués en bleu (DAPI), l’anticorps αPEP13h (dilution 1/10) reconnaissant Pmel17 est détecté par la fluorescence rouge, l’anticorps anti calréticuline, marqueur du RE (dilution 1/50) est détecté par la fluorescence verte. La fluorescence jaune spécifique de la co-localisation des deux signaux est indiquée par des flèches. Les astérisques (*) indiquent les emplacements des follicules pileux.
c. Localisation de Pmel17 dans le RE
Les analyses des résultats de marquage avec les anticorps αPEP13h couplés à l’Alexa fluor 596 (rouge) et la calréticuline couplé à l’Alexa fluor 488 (vert) montrent une faible co-localisation des protéines Pmel17 sauvage et charolaise avec la calréticuline (Figure 53). La fluorescence jaune caractéristique de cette co-localisation est observée autour des noyaux des mélanocytes folliculaires. Ce marquage périnucléaire est spécifique de la localisation de Pmel17 dans le RE.
Figure 54 : Localisation de la protéine Pmel17 dans le Golgi par microscopie confocale. Le profil de réactivité des anticorps est examiné par un triple marquage. Les noyaux des cellules sont marqués en bleu (DAPI), l’anticorps αPEP13h (dilution 1/10) reconnaissant Pmel17 est détecté par la fluorescence rouge, l’anticorps anti 58K, marqueur du Golgi (dilution 1/50) est détecté par la fluorescence verte. La fluorescence jaune spécifique de la co-localisation des deux signaux est indiquée par des flèches. Les astérisques (*) indiquent les emplacements des follicules pileux.
d. Localisation de Pmel17 dans le Golgi
Les analyses des résultats de marquage avec l’anticorps αPEP13h couplé à l’Alexa fluor 596 (rouge) et l’anticorps 58K couplé à l’Alexa fluor 488 (vert) montrent une localisation des protéines Pmel17 sauvage et charolaise dans le Golgi (Figure 54). Le profil de co-localisation est similaire à celui du RE avec une faible fluorescence jaune détectée dans la région périnucléaire au sein des mélanocytes folliculaires. Les résultats de localisation du variant Pmel17 dans le RE et le Golgi concordent avec les analyses western blotting réalisées avec l’anticorps αPEP13h indiquant la présence des formes iPmel17 et mPmel17 au sein des échantillons protéiques de peaux Charolais.
e. Localisation de Pmel17 dans l’endosome précoce et le lysosome
Malgré l’utilisation d’anticorps provenant de différentes espèces, les marqueurs des endosomes EEA1 et des lysosomes LAMP1 révèlent un marquage aspécifique sur les coupes de peaux bovines. Ces anticorps marquent les coupes de peaux sur toutes leurs surfaces avec l’apparition de points fluorescents présents de manière anarchique. La difficulté de travailler sur du matériel bovin réside dans le fait qu’il existe très peu d’anticorps sur le marché qui ciblent des protéines de cette espèce. Malgré des homologies de séquence inter-espèce, il est très compliqué d’appréhender la fonctionnalité d’anticorps dédiés à d’autres espèces sur le bovin.