Analyse de la croissance des sphéroïdes 75

Pour vérifier si le traitement MAX* pouvait avoir un effet sur les cellules F98 et U-87 MG, nous avons décidé d’essayer un modèle de croissance cellulaire tridimensionnel, soit la croissance de sphéroïde dans une matrice de Matrigel (BD). Nous avons aussi choisi de tester MAX* sur une lignée cellulaire de cancer du côlon, les HCT 116, étant donné que c- MYC est reconnu pour être surexprimé dans ces dernières (Yochum et al., 2008).

Premièrement, nous notons que la taille des sphéroïdes F98 n’est pas significativement différente à l’implantation (Figure 28). La croissance des sphéroïdes de F98 devient significativement altérée à partir de 48 heures de traitement avec MAX* (Figure 30). On observe l’effet maximal du traitement à la fin de l’expérience, soit à 120 heures où la taille des sphéroïdes est inversement proportionnelle à la concentration de MAX* : à 20 µM les sphéroïdes sont environ 70% de la taille des contrôles (p ˂ 0.01), à 50 µM environ 50% des contrôles (p ˂ 0.0001) et à 100 µM environ 38% des contrôles (p ˂ 0.0001) (Figure 31). On peut apprécier cet effet dose-réponse à partir de 72 heures post-implantation (Figure 24). Un exemple comparant de l’évolution deux sphéroïdes de F98, un traité avec 100 µM de MAX* et l’autre non-traité, est présenté à la Figure 29.

Pour ce qui est des sphéroïdes des HCT116, nous remarquons que leur taille n’est pas significativement différente à l’implantation (Figure 32). En comparaison aux sphéroïdes de F98, l’effet de MAX* apparaît plus rapidement sur ceux formés d’HCT116, soit dès 24 heures (Figure 34). On note l’effet maximal du traitement à la fin de l’expérience où la taille des sphéroïdes traités avec 100 µM de MAX* est d’environ 50% des sphéroïdes contrôles tandis que les traitements de 50 µM et 20 µM produit des sphéroïdes qui mesurent 69% et 77% des contrôles respectivement (Figure 35). Un exemple comparant de l’évolution deux sphéroïdes de HCT116, un traité avec 100 µM de MAX* et l’autre non- traité, est présenté à la Figure 33.

Figure 28 : Taille en pixels des sphéroïdes de F98 à l’implantation avant le traitement avec MAX*.

Les F98 ont été ensemencées dans les plaques à six puits à faible adhérence (Corning, Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates.) Les sphéroïdes de F98 ont ensuite été sélectionnés en fonction de leur taille (environ 100 µM de diamètre) et de leur forme : la plus sphérique possible. Des photos ont ensuite été prises par le logiciel Infinity Capture (Lumenera) à l’aide d’un microscope inversé en contraste de phase (Olympus, CKX41), avec une lentille 10X, connectée à un ordinateur par une caméra (Lumenera, Infinity 2). La lentille a été ajustée pour que la plus grande circonférence du sphéroïde de F98 soit au focus. La mesure de surface la plus grande pour chaque sphéroïde de F98 a ensuite été mesurée en pixel à l’aide du logiciel Photoshop CS5 (Adobe.) (Triplicata technique, n = 3, barre d’erreur : déviation standard)

Contrôle MAX* 100 µM

Figure 29 : Exemple d’évolution des sphéroïdes de F98 de taille similaire à l’implantation

Les sphéroïdes de F98 ont été prélevés puis transférés dans des puits contenant du Matrigel (BD, Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced LDEV- Free) ayant une concentration de 0 µM ou de 100 µM de peptide Max*. Des photos ont ensuite été prises toutes les 24 heures à partir du temps d’implantation par le logiciel Infinity Capture (Lumenera) à l’aide d’un microscope inversé en contraste de phase (Olympus, CKX41), avec une lentille 10X, connectée à un ordinateur par une caméra (Lumenera, Infinity 2.)

Figure 30 : Évolution de la croissance des sphéroïdes de F98 selon leur traitement.

La mesure de surface la plus grande pour chaque sphéroïde de F98 a été mesurée en pixel à l’aide du logiciel Photoshop CS5 (Adobe) pour chacun des temps de mesures de chacun des traitements. Un rapport entre la taille initiale de chaque sphéroïde et la taille au temps de la prise de la photo a ensuite été calculé. L’axe des ordonnées représente la moyenne des ratios de la taille des sphéroïdes de F98 au moment de la prise de données (présentée en abscisse) sur la taille des sphéroïdes de F98 au moment de leur implantation. (Triplicata technique, n = 3, * p ˂ 0.05, ** p ˂ 0.01, *** p ˂ 0.001, **** p ˂ 0.0001, barre d’erreur : déviation standard)

Figure 31 : Ratio de la taille des sphéroïdes de F98 traités avec différentes concentrations de MAX* par rapport aux sphéroïdes de F98 contrôles après 120 heures de traitement. La mesure de surface la plus grande pour chaque sphéroïde de F98 a été mesurée en pixel à l’aide du logiciel Photoshop CS5 (Adobe) à 120 heures pour chacun des traitements. Un rapport entre la taille initiale de chaque sphéroïde et la taille à 120 heures a ensuite été calculé. L’axe des ordonnées représente la moyenne des ratios de la taille des sphéroïdes de F98 au moment de la prise de données (présentée en abscisse) sur la taille des sphéroïdes de F98 au moment de leur implantation. (Triplicata technique, n = 3, ** p ˂ 0.01, *** p ˂ 0.001, **** p ˂ 0.0001, barre d’erreur : déviation standard)

Figure 32 : Taille en pixels des sphéroïdes d’HCT116 à l’implantation avant le traitement avec MAX*.

Les HCT116 ont été ensemencées dans les plaques à six puits à faible adhérence (Corning, Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates.) Les sphéroïdes de HCT116 ont ensuite été sélectionnés en fonction de leur taille (environ 100 µM de diamètre) et de leur forme : la plus sphérique possible. Des photos ont ensuite été prises par le logiciel Infinity Capture (Lumenera) à l’aide d’un microscope inversé en contraste de phase (Olympus, CKX41), avec une lentille 10X, connectée à un ordinateur par une caméra (Lumenera, Infinity 2). La lentille a été ajustée pour que la plus grande circonférence du sphéroïde soit au focus. La mesure de surface la plus grande pour chaque sphéroïde a ensuite été mesurée en pixel à l’aide du logiciel Photoshop CS5 (Adobe.) (Triplicata technique, n=3, barre d’erreur : déviation standard)

Contrôle MAX* 100 µM

Figure 33 : Exemple de l’évolution des sphéroïdes d’HCT 116 de taille similaire à l’implantation

Les sphéroïdes de HCT116 ont été prélevés puis transférés dans des puits contenant du Matrigel (BD, Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced LDEV- Free) ayant une concentration de 0 µM ou de 100 µM de peptide Max*. Des photos ont ensuite été prises toutes les 24 heures à partir du temps d’implantation par le logiciel Infinity Capture (Lumenera) à l’aide d’un microscope inversé en contraste de phase (Olympus, CKX41), avec une lentille 10X, connectée à un ordinateur par une caméra (Lumenera, Infinity 2.)

Figure 34 : Évolution de la croissance des sphéroïdes formés d’HCT116 selon leur traitement.

La mesure de surface la plus grande pour chaque sphéroïde de HCT116 a été mesurée en pixel à l’aide du logiciel Photoshop CS5 (Adobe) pour chacun des temps de mesures de chacun des traitements. Un rapport entre la taille initiale de chaque sphéroïde et la taille au temps de la prise de la photo a ensuite été calculé. L’axe des ordonnées représente la moyenne des ratios de la taille des sphéroïdes de HCT116 au moment de la prise de données (présentée en abscisse) sur la taille des sphéroïdes de HCT116 au moment de leur implantation. (Triplicata technique, n = 3, * p ˂ 0.05, ** p ˂ 0.01, *** p ˂ 0.001, barre d’erreur : déviation standard)

Figure 35 : Ratio de la taille des sphéroïdes d’HCT116 traités avec différentes concentrations de MAX* par rapport aux sphéroïdes HCT116 contrôles.

La mesure de surface la plus grande pour chaque sphéroïde de HCT116 a été mesurée en pixel à l’aide du logiciel Photoshop CS5 (Adobe) à 120 heures pour chacun des traitements. Un rapport entre la taille initiale de chaque sphéroïde et la taille à 120 heures a ensuite été calculé. L’axe des ordonnées représente la moyenne des ratios de la taille des sphéroïdes de HCT116 au moment de la prise de données (présentée en abscisse) sur la taille des sphéroïdes de HCT116 au moment de leur implantation. (Triplicata technique, n = 3,* p ˂ 0.05, ** p ˂ 0.01, *** p ˂ 0.001, barre d’erreur : déviation standard)

L’analyse de taille des sphéroïdes U-87 MG n’a pu être fait dû au caractère migratoire de ces cellules, ce qui nous empêche de pouvoir mesurer une surface comme avec les sphéroïdes de F98 ou d’HCT116. Toutefois, nous constatons que le traitement avec MAX* semble affecter ce caractère invasif (Figure 36).

Contrôle MAX* 100 µM

Figure 36 : Exemple de l’évolution de sphéroïdes de U87-MG

Les sphéroïdes de U87-MG ont été prélevés puis transférés dans des puits contenant du Matrigel (BD, Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced LDEV- Free) ayant une concentration de 0 µM ou de 100 µM de peptide Max*. Des photos ont ensuite été prises toutes les 24 heures à partir du temps d’implantation par le logiciel Infinity Capture (Lumenera) à l’aide d’un microscope inversé en contraste de phase (Olympus, CKX41), avec une lentille 10X, connectée à un ordinateur par une caméra (Lumenera, Infinity 2.)