L’analyse de la diversité des communautés bactériennes associées à la rhizosphère se heurte aux difficultés techniques d’analyse, mais surtout à la nature même du sol qui est un environnement des plus complexes et des plus hétérogènes. La figure 9. résume les principales méthodes disponibles (Ma et al., 2016).
Figure 9. Les principales méthodes d’analyse de la diversité (Ma et al., 2016).
La diversité des bactéries rhizosphériques peut être appréhendée par des techniques microbiologiques traditionnelles ou plus innovantes :
Une approche culturale qui consiste à ensemencer un échantillon sur un milieu de culture afin de permettre la croissance bactérienne et la multiplication clonale. Après dénombrement des bactéries par comptage des colonies sur milieu solide, une première caractérisation taxonomique est réalisée selon l’aspect macroscopique (forme, aspect, consistance et pigmentation des colonies isolées), la coloration de Gram, la caractérisation biochimique et les profils protéiques. Afin de déterminer avec fiabilité l’appartenance à une espèce donnée, l’identification moléculaire est principalement basée sur le séquençage et l’analyse du gène de l’ARNr 16S ou de génomes (Janssen, 2006). Cette approche présente cependant un biais certain car il est admis que seul 0,1 à 10% des bactéries de l'environnement est cultivable dans les conditions du laboratoire (Hugenholtz, 2002 ; Rappé et Giovannoni, 2003).
une approche moléculaire qui permet de comparer la diversité microbienne sur la base du génotype. Ces techniques d’empreintes moléculaires (fingerprinting) basées sur l'amplification par PCR donnent des indications quantitatives, par la mise en œuvre de l’électrophorèse en gradient de gel dénaturant (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) ou du polymorphisme de longueur de fragment de restriction terminaux (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism). Cependant même si ces techniques assez résolutives ont notamment été utilisées pour analyser les variations des communautés microbiennes de sols contaminés par les ETMs (Li et al.,
2006 ; Long et al., 2010), elles ne permettent pas d’étudier de façon qualitative la diversité microbienne à une très large échelle.
une approche de génomique environnementale par métabarcoding (Escobar-Zepeda et al., 2015). Depuis 2005, le développement des technologies de type Next Generation Sequencing (NGS) a révolutionné l’écologie microbienne en permettant d’explorer la diversité microbienne globale d’un environnement, sans a priori, par séquençage de l’ADN de tous les génomes présents dans cet environnement. Deux techniques récentes sont couramment appliquées. La technologie Ion Torrent (ThermoFischer Scientific) repose sur des puces semi-conductrices qui détectent le relargage d’ions H+ et une variation de pH dans des micro-puits lors de la polymérisation de l’ADN. Chaque micro-puits permet de séquencer un fragment d’ADN d’environ 200 bases. La technologie MiSeq (Illumina) s’appuie sur la détection de fluorescence de nucléotides ou de leurs résidus de polymérisation par un capteur optique Charge-Coupled Device (CCD). Elle permet un séquençage d’environ 300 bases dans les deux sens de lecture diminuant ainsi les risques d’erreurs. Outre la mise en parallèle des réactions de séquençage, ces deux technologies partagent quatre étapes constitutives de la méthode : (i) la préparation des librairies qui contient une étape d'amplification par PCR, (ii) les cycles de réactions de séquençage, (iii) la prise d'image après chacun de ces cycles pour déterminer le nucléotide correspondant, (iv) l'analyse bio-informatique des données. La technologie Illumina MiSeq a notamment permis d’analyser la composition et la diversité des communautés microbiennes de sites perturbés lors d’une contamination par les ETMs (Azarbad et al., 2015 ; Belimov et al., 2005 ; Chao et al., 2016 ; Chen et al., 2016 ; Durand et al., 2017 ; Foulon et al., 2016a, 2016b ; Hong et al., 2015 ; Zhang et al., 2016), des HAPs (Thomas et Cébron, 2016), du pétrole (Hou et al., 2015 ; Yergeau et al., 2015; Zheng et al., 2018) ou encore par des effluents de DMA (Wang et al., 2018). Le séquenceur Ion Torrent a également été mis à contribution pour explorer la diversité des communautés microbiennes de sols contaminés par les ETMs (Bell et al., 2015 ; Zappelini et al., 2015).
Malgré leurs hautes résolutions, l’analyse de la diversité bactérienne par les approches moléculaires dépend largement de l’extraction des acides nucléiques du sol, ce qui reste une étape cruciale puisqu’elle est une source majeure de biais (Maarit Niemi et al., 2001). Les méthodes d’extraction et de purification utilisées doivent aussi garantir l’élimination de substances inhibitrices des ADN polymérases (Kirk et al., 2004) telles que les matières humiques et les composés phénoliques associés (Engel et al., 2012). Enfin, les approches NGS permettent désormais de découvrir un nombre considérable d’unités taxonomiques opérationnelles (OTUs), mal identifiées, qui ne peuvent être rattachées qu’à des niveaux de taxonomie élevés (famille, ordre, classes ou phylum) puisque inconnues jusqu’alors.
Objectifs
Ce travail doctoral se décline en deux volets :
Le premier volet est fondamental, il a consisté à mieux appréhender la réponse adaptative de l'ensemble des microorganismes d’un anthroposol contaminé aux ETMs. Dans ce contexte, nous avons développé une approche innovante de séquençage à haut débit par Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) et Illumina MiSeq pour caractériser : (i) la diversité des populations microbiennes inféodées aux racines de peupliers et saules indigènes implantés sur le site INOVYN, (ii) la composition des communautés microbiennes rhizosphériques de bouleau, principale espèce pionnière du terril de résidus de gypse rouge de Thann. Les résultats de l’étude par métabarcoding nous ont permis d’évaluer les changements potentiels d’un point de vue taxonomique mais aussi fonctionnel des communautés de rhizobactéries dans leurs activités de coopération en relation avec ces trois espèces ligneuses et les caractéristiques des sols contaminés (Zappelini et al., 2015, 2018 in prep ; Álvarez- López et al., 2018 in prep).
Le second volet est plus appliqué, il a permis d’isoler et de cultiver des isolats microbiens à partir de sols contaminés du site de l’Ochsenfeld afin d’évaluer leurs propriétés de bioremédiation, en améliorant la reprise et la croissance du bouleau sur sols pollués (Zappelini et al., 2018 in prep).