Analyse des cavités et des canaux d’accès de la P-gp

La surface d’une protéine est d’une forme irrégulière révélant des poches et des cavités éventuellement connectées avec la surface de cette protéine par des tunnels, des canaux ou des pores. La Dans le cas de la P-gp, les changements conformationnels imposent un changement drastique de la taille des cavités et de leurs tunnels d’accès. Les substrats peuvent investir les cavités de la protéine à partir de l'environnement extérieur -ou bien à partir du milieu membranaire- selon la forme et la taille de ces tunnels connectant le cœur de protéine avec le solvant. L'anatomie des tunnels change au cours du temps en raison de la dynamique de la protéine et de la membrane.

144 Dans le cadre de notre analyse des canaux d’entrée et de sortie de la P-gp, nous avons utilisé la version en ligne du programme Mole¹⁸ [19]. Ce programme sert à localiser de manière automatisée les canaux moléculaires dans les structures protéiques. Mole nous a ainsi permis de révéler, pour chaque conformation, 5 canaux majeurs permettant l’accès au cœur de la région membranaire au niveau de laquelle seraient localisés les sous-sites de liaison des substrats de la P-gp. Ces tunnels d’accès sont présentés Figure-C-7.

A

B C

Figure-C-7 : Représentation schématique des tunnels d’accès de la P-gp dans ses trois conformations catalytiques. A, Conformation Open Facing, B, Conformation Closed

Inward-Facing, C, Conformation Outward-Facing. La P-gp est représentée en « cartoon » orange pour les trois conformations. Chaque modèle a été représenté selon l’orientation révélant au mieux les tunnels d’accès, le côté N-terminal est distingué par la lettre N, le milieu membranaire est représenté en bleu. Les tunnels d’accès sont numérotés en rouge, dans l’ordre de leur détection par Mole.

Nous pouvons constater les différences de trajectoires entre les tunnels d’accès révélés au niveau des trois conformations. Ainsi, pour la conformation Open Inward-Facing, ces tunnels relient majoritairement le cœur du milieu membranaire de la P-gp avec le milieu

18 http://mole.chemi.muni.cz: Ce programme demande à l’utilisateur un point de départ des tunnels, ainsi qu’un nombre maximal de canaux, les résultats sont donc dépendants de ces paramètres. Pour ce calcul, nous avons choisi n = 5 tunnels maxi, et comme point de départ d’exploration un point au cœur de la membrane au niveau de chaque conformation.

145 intracellulaire en distinguant néanmoins quelques accès latéraux se positionnant au niveau du feuillet intracytoplasmique de la bicouche lipidique. Ces accès sont également observés au niveau de la conformation Closed Inward-Facing mais des accès du côté extracellulaire sont également observés. Nous nous focaliserons dans cette conformation sur le point commun entre ces tunnels qui est le cœur de la membrane. En effet, la conformation Closed

Inward-Facing est imaginée comme la conformation pour laquelle la protéine a la plus grande affinité

pour le substrat. Les accès révélés vers le milieu extracellulaire montrent que le changement conformationnel a bien eu lieu et a été suivi par une ouverture (un tunnel de sortie) non observée quand la P-gp est dans la conformation Open Inward-Facing. Enfin, en analysant les tunnels d’accès révélés au niveau de la conformation Outward-Facing, nous pouvons évoquer uniquement des « chemins » de sortie pour les substrats. Dans cette configuration, les canaux sont quasi unidirectionnels vers le milieu extracellulaire, l’accès au milieu intracellulaire n’étant plus possible.

Sachant que chaque chemin d’accès est décrit par un certain nombre de résidus, nous avons essayé, pour chaque conformation, d’analyser si des résidus faisant partie des hotspots (voir Tableau 3 de [1]) participaient à la description des cinq canaux identifiés :

 Dans la conformation Open Inward-Facing, 4 résidus hotspots font partie des acides aminés délimitant les cinq tunnels révélés : au niveau de TM6E (Phe 343), de l’hélice TM11C (Phe 942 et Gln 946) et de TM12E (Ala 985).

 Dans la conformation Closed Inward-Facing, 11 résidus hotspots sont détectés : au niveau de TM6E (Phe 336, Leu 339 et Phe 343), de TM11C (Phe 938 et Phe 942), de TM11E (Tyr 950 et Phe 957) et de TM12E (Leu 975 et Val 982, Met 986 et Gln 990).

 Dans la conformation Outward-Facing, 9 résidus hotspots sont détectés : au niveau de TM6E (Ile 340 et Phe 343) et de TM12E (Leu 975, Ser 979, Val 982, Phe 983, Met 986, Gln 990 et Ser 993).

Nous pouvons remarquer qu’il y a beaucoup de résidus hydrophobes dans ces canaux/hotspots, majoritairement des grandes chaines latérales (Phe, Leu) dans les canaux de la forme A et B (Inward-Facing, Figure-C-7). Par contre, dans la forme « expulsive » (Outward), on trouve davantage de résidus polaires avec les résidus hydrophobes (Ser, Met, Gln) ce qui participe à la perte d’affinité pour les substrats hydrophobes lors de leur relargage. La plupart des résidus hotspots identifiés dans les canaux appartiennent au même groupe d’hélices TM : TM6, TM11 et TM12. Le plus grand nombre de résidus appartenant à

146 des hotspots est détecté dans la conformation Closed Inward-Facing, sorte de « conformation hybride » entre les deux extrêmes, pendant laquelle la P-gp aurait la plus grande affinité envers ses substrats.

On remarque également au cours du cycle un glissement des « hotspots » appartenant aux canaux. De la conformation Inward-Facing vers la conformation Outward-Facing, les hotspots sont d’abord majoritairement de la classe cytoplasmique, puis majoritairement de la classe exoplasmique. Ainsi, dans la conformation Open Inward-Facing, les résidus hotspots appartiennent aux deux classes cytosolique (TM11) et exoplasmique (TM6 et TM12). Dans la conformation Closed Inward-Facing, en plus de résidus cytosoliques représentatifs de l’hélice TM11, des résidus exoplasmiques de la même hélice sont détectés. Dans la conformation

Outward-Facing, les résidus hotspots de l’hélice transmembranaire TM11 ne sont plus

détectés mais essentiellement des résidus de l’hélice TM12, qui sont tous de la classe exoplasmique. Ce résultat est intéressant, car il est compatible avec l’idée que dans cette conformation, la P-gp est dans la phase d’expulsion de son substrat.

Alors que la localisation membranaire plutôt constante des résidus hotspots, révélée dans Bessadok et al., semble favoriser le modèle de transport : « floppase », notre étude des canaux d’accès met en évidence la possibilité que l’autre modèle de transport supposé « aspirateur hydrophobe ou Vacuum cleaner » puisse aussi être utilisé par la P-gp. Ainsi, nous remarquons qu’au niveau de la conformation Closed Inward-Facing supposée représenter un état intermédiaire, le nombre de résidus hotspots exoplasmiques est nettement supérieur à celui des résidus hotspots cytosoliques. L’ouverture vers le feuillet exoplasmique de la membrane semble être favorisée.