No rim, o padrão de resposta aos tratamentos utilizados não foi o mesmo observado nos órgãos anteriormente descritos. Observa-se um nível basal da isoforma induzida que, diferente dos demais, é proporcionalmente grande em relação aos níveis pós-LPS (Figura 4, painel A). Após a
V .
administração de endotoxina observa-se uma elevação nos níveis da isoforma cálcio-independente (em torno de 3x). Curiosamente, o pré-tratamento com a dexametasona não reduziu o aumento causado pelo LPS. Além disso, os animais pré-tratados com SNAP (antes da dexametasona e do LPS) mantiveram valores aumentados (em torno de três vezes) nos níveis desta isoforma.
Em relação aos níveis d a . enzima cálcio-dependente, nenhuma diferença significativamente relevante foi observada entre todos os grupos.
1 . 2 5 ' ■ D ' 5 1 . 0 0 - 1 - S S" 0-75-
^
I 0.50- ^ 1 0.25J 0.0 0- ENZIMA CALCIO-INDEPENDENTE PBS LPSENZIMA CÁLCIO-DEPENDENTE
0.4' "(O <ü .E I % 0-3- j 0.1- O.O' PBS LPS DEXA SNAP+DEXA+LPSFigura 4: Perfil enzimático das NOS no rim de ratos submetidos a diversos tratamentos. Painel A: NOS cálcio-independente e Painel B: NOS
cálcio-dependente. Ratos foram submetidos aos diversos tratamentos (como mostrado na seção de Métodos) e 8 horas depois da injeção de LPS, o rim (direito e esquerdo, foram coletados e congelados à -70°C para posterior dosagem da atividade das NOS pelo método da citrulina (como descrito na seção de Métodos). Cada barra representa a média ± EPM de 3-6 determinações e expressa a atividade total de cada isoforma. Para a análise estatística foi utilizada a análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste id e Bonferroni. * p < 0.05 em relação aos animais controle (primeira barra ã esquerda). Atentar para as escalas de atividade das duas isoformas.
6.5 Perfil Enzimático de NOS na Musculatura Esquelética de Ratos Submetidos a Diversos Tratamentos.
A dosagem dos níveis das duas isoformas da NOS feitas na musculatura esquelética mostrou um resultado interessante: ao contrário do observado nos outros órgãos, o padrão de resposta no que se refere à sensibilidade ao corticóide, à resposta à injeção de endotoxina e à resposta ao pré-tratamento com o doador de NO foi encontrado na isoforma dependente de cálcio. Como pode ser observado na Figura 5, Painel B, o tratamento com LPS elevou seus níveis para cerca do dobro do controle, enquanto que a dexametasona inibiu cerca de 90% do aumento causado pelo LPS. O pré-tratamento com o doador de NO reverteu a inibição para praticamente os mesmos níveis vistos com o tratamento com LPS. Portanto, viu-se na musculatura esquelética um perfil da isoforma cálcio-dependente que é muito similar ao da isoforma cálcio- independente nos outros órgãos. Finalmente, nenhum efeito significativamente relevante foi observado para a isoforma cálcio-independente (Figura 5, painel A).
ENZIMA CALCIO-INDEPENDENTE
ENZIMA CALCIO-DEPENDENTE
DEXA SNAP+DEXA+LPS
Figura 5: Perfil enzimático das NOS na musculatura esquelética de ratos submetidos a diversos tratamentos. Painel A: NOS cálcio-
independente e Painel B: NOS cálcio-dependente. Ratos foram submetidos aos diversos tratamentos (como mostrado na seção de Métodos) e 8 horas depois da injeção de LPS o músculo rectus femoris e músculos adjacentes, como
gracilis e gluteos superficialis, foram coletados e congelados à -70°C,
considerados como uma única amostra, para posterior dosagem da atividade das NOS pelo método da citrulina (como descrito na seção de Métodos). Cada barra representa a média ± EPM de n determinações e expressa a atividade total de cada isoforma. Para a análise estatística foi utilizada a análise de variáncia de uma via (ANOVA) seguida pelo teste id e Bonferroni. * p < 0.05 em relação aos animais controle (primeira barra à esquerda). Atentar para as escalas de atividade das duas isoformas.
6.6 Efeito dos Diversos Tratamentos no Peso do Baço
Sendo o baço um rico tecido linfóide e tendo-se em conta o bem documentado efeito dos glicocorticóides na indução de apoptose em linfócitos, resolveu-se avaliar se o NO estaria interferindo com outra ação dos corticóides que não a indução da NO sintase. Os resultados destes experimentos estão mostrados na Figura 6. No grupo controle verifica-se que os baços representam cerca de 0,33% do peso corporal dos animais. Nos animais tratados somente com dexametasona, houve uma redução no tamanho do baço em torno de 60%, confirmando nossa hipótese de que este órgão é sensível ao aumento da concentração plasmática de corticóides. A injeção de LPS causou um aumento de aproximadamente 1,5 vezes no peso do baço em relação aos animais controle. A injeção prévia de dexametasona diminuiu o efeito do LPS em torno de 40%. Os baços dos animais que foram pré-tratados com o doador de NO e depois com dexametasona e LPS praticamente dobraram de tamanho (0,26% para 0,49%), indicando que o efeito inibitório da dexametasona deixou de existir. Assim, podemos observar em nosso experimentos uma relativa diminuição do tamanho do baço em animais tratados com dexametasona e elevação do peso deste órgão quando os animais foram tratados com LPS e com o doador de NO.
S V Q. O tf) 0) Q. 0 . 6 - 0 .5 - & 2- 0.3- s 8 0.2- 0.1- 0.0- PBS LPS * # DEXA SNAP+DEXA+LPS
Figura 6; Variações no peso do baço em ratos submetidos a diversos tratamentos. Painel A: animais injetados com salina e Painel B: animais
injetados com LPS (5 mg/kg). Ratos foram submetidos aos diversos tratamentos (como mostrado na seção de Métodos) e 8 horas depois da injeção de LPS os animais foram pesados, sacrificados, o baço foi retirado e pesado em balança analítica. Os resultados estão expressos como % do peso do baço em relação ao peso corporal de cada animal. Cada barra representa a média ± EPM de 3-6 determinações. Para a análise estatística foi utilizada a análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste t de Bonferroni. *p < 0.05 em relação aos animais tratados somente com dexametasona (segunda barra à esquerda) e # p < 0.05 em relação aos animais tratados com dexametasona + LPS (quarta barra à esquerda). Atentar para as escalas de atividade das duas isoformas.
6.7 Dosagem de NOx no Soro de Animais Submetidos a Diversos T ratamentos
O nível de NOx sérico é pouco Indicador de quais órgãos ou tecidos estão produzindo NO. Ainda assim, como neste trabalho estamos interessados na produção global de NO (já que muitos tecidos não analisados aqui também contribuem para os níveis séricos de NOx), analisamos este parâmetro frente aos diversos tratamentos (Figura 7). A quantidade de NOx no soro de animais tratados com LPS aumentou 52 vezes, confirmando uma grande produção de NO. A utilização prévia de dexametasona nos animais tratados com LPS levou os níveis de NOx praticamente à zero. O SNAP, administrado antes do corticóide, causou um retorno nos níveis de NOx equivalente aos dos animais com LPS somente.
DEXA+LPS SNAP+DEXA+LPS
Figura 7: Níveis de NOx no soro de ratos submetidos a diversos tratamentos. Ratos foram submetidos aos diversos tratamentos (como
mostrado na seção de iVlétodos) e 8 horas após a injeção de LPS, retirou-se 1 ml de sangue, deixou-se coagular e retirou-se o soro que foi congelado à - 70°C para posterior dosagem. Cada barra representa a média ± EPM de 3-6 determinações e está expressa em pM, calculado a partir de uma curva-padrão de nitrato. Para a análise estatística foi utilizada a análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste t de Bonferroni. * p < 0.05 em relação aos animais controle (primeira barra à esquerda).
7. Discussão
Hoje não resta nenhuma dúvida que o NO é um dos principais participantes no quadro da sepse/choque séptico (Fleming eía/.,1990; Parrat et a/.,1998; Beishuizen eía/.,1999), tanto em animais de experimentação quanto em humanos (Tsuneyoshi et a i, 1996). É importante ressaltar que a maior parte do NO importante no quadro séptico é originário da enzima cálcio- independente (Stoclet et aí., 1999). Em modelos experimentais de administração de LPS em animais ocorre a indução da expressão desta enzima em muitos tecidos e órgãos (Knowles et a i, 1990; Salter et a i, 1991; Cunha et a/.,1994). Este processo inicia-se 2 horas após a administração da endotoxina, atingindo o pico máximo de atividade enzimática entre 6 e 12 horas (Knowles et
a!., 1990; Salter et a/.,1991; Cunha et a i, 1994). A indução desta enzima
também ocorre em vários outros modelos que simulam, em maior ou menor grau, o quadro de choque séptico humano, onde também é observado um processo de indução da enzima NOS cálcio-independente (Spack et a/.,1997). A indução desta enzima, contudo não é exclusividade do choque séptico, mas ocorre em uma grande variedade de outras condições da fisiologia animal e humana, notadamente na resposta inflamatória (Nussier & Billiar, 1993). No nosso trabalho optamos que a obtenção do material para análise fosse feita na oitava hora após a injeção de LPS. Esta escolha deveu-se aos fatos de que a atividade da INOS ser máxima ao redor deste tempo e também por uma questão de conveniência, por causa dos vários tratamentos que precederam a injeção de LPS. Dos órgãos do rato analisados no nosso trabalho, os que melhor responderam em termos de indução da NOS após a injeção de LPS foram o pulmão, o baço, o rim e a musculatura esquelética. O exame atento
dos níveis de NOS medidos em cada um deste órgãos nos permite verificar que há uma variação muito grande entre os níveis da enzima nos diferentes órgãos. IVlais ainda, outros órgãos, como por exemplo a aorta, simplesmente não mostraram quantidades mensuráveis de NOS após injeção de LPS. Cunha
et al. (1994) demonstraram que a indução diferencial de iNOS em diversos
tecidos do camundongo deve-se ao efeito diferencial de TNF-a e IL-ip. Assim é que a indução de iNOS em determinados órgãos parece ser estritamente dependente destas citocinas, enquanto que em outros a remoção das 'mesmas nada acarretou, indicando que outras citocinas devem ser mais importantes. Além disso, Rees et al. (1995) tratando camundongos com a bactéria C.
parvum demonstraram que a indução da expressão de NOS ocorre inicialmente
em macrófagos e no fígado, seguida pela indução da expressão no baço, no coração e na aorta ao longo de vários dias (30 no total) sugerindo que a liberação sequenciada de citocinas causou a indução escalonada temporalmente de INOS. Desta forma, é possível que os diferentes níveis de NOS encontrados nos vários órgãos de rato após o tratamento com LPS devam-se à uma expressão diferencial qualitativa e temporal. Outras possibilidades também devem ser levadas em conta, tais como diferentes níveis de receptores de LPS, abundância relativa e vida-média do mRNA da NOS, diferentes mecanismos de transdução de sinal e de transdução gênica, etc. que poderiam explicar estas diferenças.
Um achado bastante curioso dentro dos nossos resultados foi a indução de uma enzima cálcio-dependente na musculatura esquelética dos ratos tratados com LPS. Baseado na literatura, que só descreve um tipo de NOS na musculatura esquelética, a assim chamada pNOS, considerada como uma
variante da nNOS específica em músculo esquelético, cremos que a atividade detectada no nosso ensaio possa ser atribuída à esta enzima. A função fisiológica desta enzima ainda não está bem esclarecida, porém alguns relatos apontam efeitos do NO gerado por esta enzima no acoplamento excitação- contração do músculo, na auto-regulação do fluxo sangüíneo, na diferenciação de miócitos, na respiração ,e na regulação da homeostasia da glicose. A localização e atividade da pNOS parece ser regulada por interações proteína- proteína e por modificações co- ou pós-translacionais (para revisão ver Stamier & Meissner, 2001). Não há relato na literatura mostrando o efeito de LPS sobre os níveis desta enzima, mas, no caso dela realmente ter a sua expressão aumentada pelo LPS, isto poderia explicar a caquexia observada durante o choque séptico, decorrente da excessiva produção de NO pela |jN0S que
acabaria por interferir em todos os processos fisiológicos da musculatura esquelética. De qualquer modo, este resultado mostra que o papel das chamadas NOS cálcio-dependentes deve ser reavaliado no quadro de choque séptico, por estudos analisando a expressão de mRNA destas enzimas.
Outro achado muito curioso do nosso trabalho foi o fato de que a dexametasona também interfere por si nos níveis de NOS cálcio-dependentes. Assim, ao analisarmos o baço dos animais tratados somente com dexametasona, observamos que os níveis de NOS cálcio-dependente foram maiores quando comparados aos níveis dos animais controle. O aumento na expressão de NOS cálcio-dependente já havia sido descrita no tecido vascular por Nishida et al. (1992) em resposta ao estresse de cisalhamento e por Weiner et al. (1994) em resposta ao tratamento com estrogênio. Ainda não se
sabe o mecanismo pelo qual o corticóide exerce este efeito talvez, por aumento da transcrição protéica, nem qual a relevância disso para a fisiologia normal.
A resposta inflamatória é um complexo processo fisiológico essencial à manutenção da homeostasia e consequentemente para a sobrevivência de um organismo. É bem sabido que em situações de estresse ou em resposta a estímulos inflamatórios, o organismo aumenta os níveis de glicocorticóides endógenos na tentativa de reajustar a homeostasia. Também é bem conhecido o fato de que a injeção prévia de glicocorticóides inibe vários aspectos da resposta inflamatória (onde o quadro de sepse se insere). Assim, a inibição da indução da expressão de NOS causada por glicocorticóides, demonstrada inicialmente por Rees et aí. (1990) e Wright et aí. (1992) foi confirmada em nossos resultados, já que a administração prévia de dexametasona causou forte inibição da indução de enzimas cálcio-independentes (no pulmão e no baço) e cálcio-dependente (na musculatura esquelética) dos animais tratados com LPS. Mais ainda, este efeito inibitório da dexametasona sobre a indução da NOS deve ser muito mais amplo do que nós pudemos ver, já que os níveis séricos de NOx (que espelham o total de atividade de NOS em um organismo) também diminuem bastante em resposta ao tratamento prévio com o corticóide.
A dexametasona entretanto falhou em inibir a indução da NOS causada pelo LPS no rim. Embora não tenhamos uma explicação clara para esta observação, isto poderia estar relacionado á, por exemplo, uma menor população de receptores de corticóides encontrados neste órgão. Sabendo da importância dos hormônios e receptores mineralocorticóides na manutenção de vários aspectos da fisiologia renal e da imensa quantidade da enzima 11-p- hidroxiesteróide desidrogenase presente no rim, que confere á este órgão
nítida predileção pela ligação com mineralocorticóides, pode ser que os glicocorticóides tenham efeitos menores no rim. Alternativamente, a ausência do efeito da dexametasona em inibir a indução da NOS causada pelo LPS no rim poderia ser atribuída a um aspecto hemodinâmico/farmacocinético. Como o rim entra em falência durante um choque séptico (Sandin, 1993), pode ser que simplesmente não haja entrada suficiente de dexametasona para ligar-se aos seus receptores em quantidade adequada para inibir a indução da NOS. Outra possibilidade seria que, como acima descrito, o sistema de indução da NOS no rim fosse diferente dos demais órgãos, por depender de citocinas ou de mecanismos de transdução distintos dos demais.
A questão central que aparece entretanto é a seguinte: se os glicocorticóides são tão potentes em inibir a indução da iNOS e se o NO é tão importante na fisiopatologia do choque, porque a administração de corticóides
depois da instalação da sepse falha totalmente em mudar o curso deste
quadro clínico? (Thompson, 1993; Bone,1991; Cohen & Glauser, 1991). Porque a utilização de drogas tão eficazes como anti-inflamatórios, após a instalação
do choque séptico, não cessa a seqüência de reações que, em 50 a 70% dos
casos, acaba por matar o paciente?
O principal achado deste estudo sugere uma resposta, pelo menos parcial, ã esta pergunta: o próprio NO produzido em excesso durante o choque séptico interfere nos efeitos dos glicocorticóides.
Os experimentos mostrando que a administração de SNAP, um doador de NO, efetuada antes do corticóide (simulando a excessiva produção de NO durante o choque séptico) reverteu totalmente o efeito anti-inflamatório da dexametasona indica, claramente, que este mecanismo deva ser operativo
para explicar a falha dos GC no choque séptico. Este artifício (injeção de SNAP) possibilitou a avaliação da ação do NO sobre os efeitos do glicocorticóide analisada sob 3 aspectos: inibição da indução de NOS, apoptose de células linfóides do baço e níveis séricos de NOx. Em todas as três formas de avaliação, o doador de NO mostrou-se eficaz em impedir o efeito do glicocorticóide, ou seja, os níveis de NOS mantiveram-se elevados no pulmão, baço e musculatura esquelética, a diminuição do tamanho do baço (indicando apoptose de células linfóides) causado pelo glicocorticóide não ocorreu e os níveis séricos de NOx nos animais pré-tratados com SNAP foram os mesmos encontrados em animais injetados somente com LPS.
Um dos possíveis mecanismos pelo qual o NO interfere no efeito do glicocorticóide foi sugerido por Galigniana et al. (1999) em estudos realizados
in vitro, demonstrando que o binding do receptor de glicocorticóide está
diminuído de forma tempo- e concentração-dependente na presença de doadores de NO. Os autores sugerem que a razão para a perda da capacidade do ligante de interagir com o receptor seria a nitrosilação, pelo NO, de resíduos de cisteína críticos ao funcionamento do GR. Esta sugestão é baseada no fato de que a incubação simultânea de doadores de NO e DTT (agente protetor de sulfidrilas) abole o efeito do NO sobre o binding do ligante com o GR. Esta informação é sustentada ainda pelas seguintes evidências: i) pela capacidade que a molécula de NO tem de reagir com vários alvos intracelulares, principalmente sulfidrilas de cisteínas (Fang, 1997); ii) que desta interação resulta a formação de S-nitrosotióis; e que iii) em algumas circunstâncias, através da formação de pontes dissulfeto entre duas sulfidrilas vicinais de S- nitrosotióis (Arnelle & Stamier, 1995), pode ocorrer a mudança conformacional
ou a adoção de uma conformação inativa de proteínas, que resulta no comprometimento de suas funções fisiológicas.
No entanto, como estes estudos foram realizados somente in vitro com receptores purificados de fibroblastos de camundongos, afirmar que este seja realmente o mecanismo pelo qual o glicocorticóide deixa de exercer suas funções anti-inflamatórias in vivo, seria uma extrapolação perigosa sem a demonstração cabal da ocorrência deste mecanismo durante um choque séptico.
Nossos resultados demonstram claramente que o NO inibe a ação do glicocorticóide in vivo. Apesar das respostas dos órgãos terem sido diferentes entre si, o que novamente confirma a expressão diferencial qualitativa e temporal das NOS, não resta dúvida que o SNAP causa uma nítida reversão do efeito do glicocorticóide (inibição da indução de NOS).
Comparado aos outros tecidos estudados, o pulmão parece ser um órgão extremamente sensível ao efeito inibitório na indução de NOS independente de cálcio efetuado pela dexametasona. Além disso, o mecanismo envolvido neste processo parece ser também extremamente sensível à presença de NO, já que a administração prévia de SNAP reverteu
completamente o efeito do glicocorticóide. Estas evidências sugerem que o
receptor esteróide envolvido no processo deva ser mais sensível ao efeito de S-nitrosilação, quando comparado aos outros órgãos, e que cisteínas críticas ao funcionamento do receptor possam estar S-nitrosiladas. No entanto, para confirmarmos a veracidade destas possibilidades que coincidem com as sugestões apresentadas no estudo feito in vitro, haverá necessidade de
experimentos realizados in vivo abordando o estado do receptor, em termos de densidade e afinidade pelo ligante, em nossas condições experimentais.
Uma outra situação que talvez seja análoga à nossa seria a observação, por outros autores, de que há uma resistência a glicocorticóides em pacientes asmáticos (Barnes, 1998). Com base nos nossos resultados e no fato de que vários trabalhos da literatura mostram a presença de NOS cálcio-independente em pacientes asmáticos, é tentador sugerir que o NO possa estar inativando os receptores de glicocorticóides, contribuindo para o agravamento do quadro asmático. Este mecanismo talvez seja mais importante do que outros sugeridos para explicar esta resistência, tais como níveis aumentados de cortisol circulante, interação do receptor com fatores de transcrição e diminuição no
binding do receptor de glicocorticóide por diminuição da densidade de
receptores ou afinidade pelo ligante (Barnes, 1998).
Um dos principais mecanismos pelo qual o organismo mantém a homeostasia em situações onde o sistema imune é ativado parece ser o antagonismo entre NF-kB e os glicocorticóides. Sinais que ativam o NF-kB como infecções bacterianas e virais e estresse oxidativo, são interpretadas pelo organismo como estímulos estressantes. Estes estímulos ativam o eixo HPA, aumentando os niveis de glicocorticóide circulantes. Sabendo-se que o NF-kB também é ativado por intermediários reativos de oxigênio e, uma vez que estes são liberados e produzidos durante uma resposta inflamatória, a via de ativação do NF-kB é fisiologicamente relevante em situações de estresse. A ativação de NF-kB por ROS pode ser inibida por agentes redutores ou