Allongement de la séquence Re-1 en régions 5’ et 3’

Pour poursuivre l’allongement de la séquence Re-1 en régions 5’ et 3’, de l'ADN génomique d’A. acutiuscula a été digéré par l’enzyme de restriction ApaI (Fig. 36). Cette dernière ne coupe pas dans Re-1 permettant ainsi d'obtenir en même temps les deux séquences flanquantRe-1 par iPCR.

Figure 36 : Schéma permettant de localiser les amorces ayant servi à l'allongement du fragment reconstruit Re-1 de 1268 pb.

L'enzyme ApaI qui ne coupe pas Re-1 a été choisie. Les amorces AcutR5ext et AcutF6ext (pour externe, flèches bleues) ont été utilisées pour la iPCR n°1 et les amorces AcutR5int et AcutF6int (pour interne, flèches rouges) pour la iPCR n°2. La lignepointilléereprésenteles régions bordant la séquence Re-1 en 5' et en 3'.

Après les deux amplifications successives, un fragment d’environ 2000 pb a été observé (Fig. 37-B).

Figure 37 : Migration sur gel d’agarose des produits d’amplification pour l’obtention des fragments flanquant la séquence Re-1.

A - Puits 1 : produit de la première iPCR utilisant comme matrice l’ADNg digéré par l'enzyme

ApaI et le couple d'amorces externes AcutR5ext et AcutF6ext. B - Puits 1 : produit de la seconde iPCR utilisant comme matrice le produit de la iPCR précédente et le couple d'amorces internes

AcutR5int et AcutF6int. M : marqueur de taille GeneRuler 100 pb. T- _{: témoin négatif (iPCR}

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Ce dernier a été cloné, deux clones ont été séquencés et nommésApaIR5F6-1 et ApaIR5F6-2. Ils ont une taille respective de 1982 et 1983 pb etsont identiques à 99,3 %. Pour l’analyse, seul le clone ApaIR5F6-1 a été utilisé. Au niveau du site de l'enzyme ApaI, il a été séparé en deux fragmentsApaR5F6-5' et ApaR5F6-3' qui ont été alignés avec Re-1 (Fig. 38-A).

En région 5', un bon alignement du fragment ApaR5F6-5' avec l'extrémité 5' de Re-1 a permis d'allonger ce dernier d'environ 300 pb (Fig. 38-B). En région 3’, le fragment ApaIR5F6-3' de 1579 pb et la séquence Re-1 présentent un bon alignement sur une longueur de 220 bases suivi par un très mauvais alignement des 640 dernières bases de Re-1. A partir de ces résultats, deux séquences Re-2.1 et Re-2.2 ont pu être établies. La séquence Re-2.1 a été assemblée en associant depuis la région 5’ vers la région 3’ : ApaIR5F6-5', Re-1 et ApaIR5F6-3'. La séquence Re-2.2 n’a été allongée qu’en région 5’ en associant uniquement les fragments ApaIR5F6-5' et Re-1. Ces deux séquences reconstruites partagent une partie identique de 1155 pb à l'extrémité 5', suivie d'une partie variable en région 3' (Fig. 39).

La comparaison par BlastX de Re-2.1 et -2.2 avec les banques de données a permis de confirmer qu’elles possèdent bien une homologie avec des transposases de type MLE, et notamment avec celle de la betterave Beta vulgaris (37 et 39 %, respectivement) et de la diatomée marine Pseudo-nitzschia multiseries (39 %).

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Figure 38 : A) Schéma de l’alignement de la séquence Re-1 avec les fragments ApaIR5F6-5' et ApaIR5F6-3'. B) L’assemblage de ApaIR5F6-5' et ApaIR5F6-3' avec Re-1, d’une part et de ApaIR5F6-5' avec Re-1 d’autre part a permis de reconstruire deux séquences différentes.

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Figure 39 : Alignement des séquences reconstruites Re-2.1 et Re-2.2. Elles sont identiques sur 1155 pb en région 5', la région 3' est variable.

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Dans la région 5' de Re-2.1 et -2.2, l’analyse a permis d'identifier un motif HTH similaire à celui d'autres transposases disponibles dans les banques de données. En complément, la recherche du motif HTH a été effectuée en utilisant un logiciel spécifique "HTH prediction", le score obtenu étant faible (2,48- probabilité non significative) montre que ce motif est mal défini. Cependant, le logiciel de prédiction indique la présence d'un autre HTH en amont de celui détecté précédemment avec un score significatif de 3,25 (probabilité 50 %).Un signal de localisation nucléaire a été détecté, après lesmotifs HTH, grâce à l'utilisation du logiciel NLS Mapper. Ainsi en région 5', les séquences Re-2.1 et -2.2 présentent, comme beaucoup de transposases, deux HTH et un NLS (Fig. 40). Toutefois la méthionine de départ n’a pas été trouvée,indiquant qu'il est nécessaire de poursuivre la marche le long de la séquence en direction de l’extrémité 5'.

Figure 40 : Traduction en protéine de l'extrémité 5' identique des deux séquences Re-2.1 et -2.2 et positionnement des motifs caractéristiques des transposases.

En région 5' des séquences Re-2.1 et -2.2, deux motifs HTH (Hélice-Tour-Hélice) et un motif NLS (Signal de localisation nucléaire) ont été prédits par les logiciels HTH prédiction et NLS Mapper.

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Le mauvais alignement d'une partie de l'extrémité 3' du fragment ApaR5F6-3' avec la séquence Re-1 nous a conduit à vérifier l’existence des séquences reconstruitesRe-2 dans le génome d’A. acutiuscula. Pour cela, une amorce spécifique s’hybridant près de l’extrémité 3’ de chacune des deux séquences Re-2.1 et Re-2.2 a été définie, il s’agit des amorces antisens VRe-2.1 et VRe-2.2 (Fig. 41). Pour un meilleur accrochage, les amorces antisens ont été définies quelques bases en amont de la fin de la séquence. L’amorce sens AcutF6int s’hybride, quant à elle, dans une zone très conservée du gène de la transposase sur le motif contenant le troisième acide aspartique de la triade catalytique. Chaque couple d’amorces doit permettre l’amplification du fragment allant de la partie terminale du gène de transposase jusqu’à l'extrémité 3' du fragment reconstruit et donc de vérifier l'existence de ce dernier dans le génome-hôte (Fig. 42). Dans les deux cas, les produits de PCR présentaient la taille attendue qui est de 1085 pb pour l’élément Re-2.1 et 543 pb pour l’élément Re-2.2. Ces fragments ont été clonés puis séquencés. Leur amplification a permis de confirmer par alignement (Fig. 43 et 44) qu’il existe bien dans le génome d’A. acutiuscula deux éléments distincts, le premier ayant en extrémité 3’ la séquence présente dans Re-2.1 et le second la séquence 3’ définie dans l’élémentRe-2.2.

Figure 41 : Schéma de la localisation des amorces utilisées pour vérifier la présence des séquences des éléments reconstruits Re-2.1 et Re-2.2.

Utilisation du couple d'amorces AcutF6int et VRe-2.1 pour la mise en évidence de Re-2.1 et du couple d’amorces AcutF6int et VRe-2.2 pour cellede Re-2.2.

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Figure 42 : Amplifications à partir de l’ADNg d’A. acutiuscula des fragments de vérification des régions 3’ des séquences Re-2.1 et -2.2.

Puits 1 : produit de PCR obtenu avec le couple d'amorces AcutR6int et VRe-2.1 ; Puits 2 : produit de PCR obtenu avec le couple d'amorces AcutR6int et VRe-2.2. M : marqueur de taille Generuler 100 pb. T- _{: témoin négatif (PCR réalisée sans matrice ADNg).}

Les séquences Re-2.1 et Re-2.2 ont une longueur de 2494 et 1554 pb, respectivement.

Elles possèdent 1074 et 543 pb au-delà du 3ème D de la triade catalytique, il est donc possible qu'elles contiennent la fin de l’élément transposable, l'UTR3' et l'ITR 3'. En région 5', le codon start n'ayant pas encore été détecté, cette région doit encore être allongée pour obtenir la région antérieure de la transposase ainsi que l'UTR et l'ITR 5'. Une fois l'allongement effectué en 5', les deux régions seront comparées pour déceler la présence éventuelle des ITR. Si tel n'est pas le cas, la marche vers les deux extrémités sera alors reprise.Dans le paragraphe suivant la priorité est donnée à l'allongement de la région 5' des séquences Re-2 (2.1 et 2.2).

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Figure 43 : Alignement du fragment F6int/VRe-2.1 avec la région 3' du fragment reconstruit Re-2.1. Sur la partie amplifiée, les deux fragments ont une identité de 99,53 %.

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Figure 44 : Alignement du fragment de vérification F6int/VRe-2.2 avec la région 3' de la séquence reconstruite Re-2.2. Sur la partie amplifiée, les deux fragments possèdent une identité de 99,45 %.

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Figure 45 : Schéma permettant de localiser les amorces ayant servi à l'allongement de l'extrémité 5' de Re-2.1 (A) et Re-2.2 (B).

L'enzyme EcoRV qui coupe les séquences Re-2 au niveau du domaine de liaison à l'ADN a été choisie. Les flèches en bleu et en rouge représentent les deux couples d'amorces nichées utilisés. Les amorces AcutR10ext et AcutF13ext (pour externe) ont été utilisées pour l'iPCR n°1 et les amorces AcutR10int et AcutF13int (pour interne) pour l'iPCR n°2. La lignepointilléereprésenteles régions bordant les séquences Re-2.

Figure 46 : Amplification par iPCR du fragment bordant l'extrémité 5' des séquences Re-2.

A- Puits 1 : amplification par iPCR en utilisant l’ADN génomique digéré par l'enzyme EcoRV, comme matrice et le couple d'amorces externes AcutR10ext et AcutF13ext. B - Puits 1 : amplification par iPCR en utilisant comme matrice le produit de l'iPCR précédente et le couple d'amorces internes AcutR10int et AcutF13int. M : marqueur de taille 100 pb. T- _{: témoin négatif}

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