5.1 Experimentos
Para o desenvolvimento do estudo foram realizados dois experimentos com o intuito de: 1) identificar o comportamento espectral de cultivares de uva e 2) Correlacionar as imagens espectrais de uvas com características físico-químicas. Os procedimentos desta pesquisa foram realizados nas dependências do Laboratório de Termodinâmica e Energia (LTE) e do Laboratório de Tecnologia de Pós-Colheita (LTPC), na Faculdade de Engenharia Agrícola da Universidade Estadual de Campinas (FEAGRI/UNICAMP), onde as uvas foram acondicionadas a temperatura de 5ºC em câmara fria durante o período de análises e dispostas na própria embalagem de aquisição confeccionadas em papelão e dimensões 40cmx10cmx30cm (C x H x L).
O primeiro experimento teve como intuito identificar o comportamento espectral de três variedades de uvas com cores distintas, e posteriormente analisar a possibilidade de diferenciação entre essas variedades através do uso de imagens espectrais de refletância e fluorescência (com excitação de 405nm e 470nm) no espectro visível (VIS). Já o segundo experimento pretendeu correlacionar os dados espectrais e a variável físico-química de sólidos solúveis em uvas frescas e desidratadas parcialmente, com o uso de regressão multivariada através de imagens espectrais de refletância e fluorescência (com excitação de 405nm e 470nm) no espectro visível (VIS).
5.2 1º Experimento
O primeiro experimento teve como intuito identificar o comportamento espectral de três variedades de uvas com cores distintas, e posteriormente analisar a possibilidade de diferenciação entre essas variedades através do uso de imagens espectrais de refletância e fluorescência (com excitação de 405nm e 470nm) no espectro UV-VIS (ultravioleta e visível).
5.2.1 Unidades Experimentais
As amostras de uva são oriundas da região do Vale do São Francisco – BA, e após a colheita e o transporte até o entreposto do CEASA em Campinas-SP. Para este experimento foram utilizadas uvas de mesa da espécie Vitis vinifera L., com diferentes colorações: A)
cultivar Brasil (tinta), B) cultivar Benitaka (coloração próxima ao rosa) e C) cultivar Itália (branca) (Figura 5).
Figura 5: Tipos de cultivares de uva: (A) cultivar Brasil; (B) cultivar Benitaka e (C) cultivar Itália.
5.2.2 Instrumentação
As análises físico-químicas foram feitas através das medidas de sólidos solúveis, acidez titulável e pH dos cultivares de uva. A determinação dos sólidos solúveis foi feita a partir da leitura direta em refratômetro digital (marca Artago, modelo PR-101), utilizando-se duas gotas da amostra triturada e homogeneizada, com os resultados expressos em °Brix.
Para a determinação da acidez titulável, foi utilizado o método potenciométrico, que consiste em uma simples titulação com base padronizada, e que é comumente utilizado em alimentos coloridos. Este método consiste em titular com NaOH (0,1M) a solução de produto até atingir o pH 6.0 e depois até atingir o pH 8.1. Em seguida, por interpolação dos dados determina-se a acidez titulável total do produto, a partir da Equação 1 (CECCHI, 2003; JOSLYN, 1970; POMERANZ, 2013):
= . . (1)
Onde:
ma – Acidez titúlavel da amostra; Ma – Massa da amostra;
Mb – Molaridade do reagente; Vb – Volume do reagente;
A determinação do pH foi realizada a partir da medida da concentração de íons hidrogênio contido na amostra, por meio de um pHmêtro digital (marca Instrutherm, modelo PH-1500), com faixa de medida de 0 a 14 pH, erro de ± 0.02 pH e resolução de 0.01 pH. Essa medida foi determinada com três repetições para cada cultivar de uva. O equipamento foi devidamente calibrado com soluções-tampão padrão de pH 4.0 e pH 7.0 a temperatura de 20°C.
O sistema de aquisição de imagens espectrais de refletância e fluorescência foi dimensionado no Laboratório de Fotônica do Instituto de Física de São Carlos da Universidade de São Paulo (IFSC/USP) na cidade de São Carlos – SP, e é composto por: a) sistema de câmera e filtros (com uma câmera CCD, lentes e filtro ótico), b) suporte para o sistema de iluminação, c) sistema de iluminação (com LEDs), d) caixa acrílica para acondicionamento do produto, e e) uma base metálica de sustentação (Figura 6).
Figura 6: Esquema de instalação do sistema de aquisição de imagens espectrais.
O sistema de iluminação é formado por diodos emissores de luz (LEDs) de alta potência, com aproximadamente 200 mW por diodo. Neste sistema há 3 tipos de LEDs, os LEDs que apresentam comprimento de onda nos espectros 405 e 470nm (para aquisição de imagens de fluorescência), da marca Cree com variação de luminosidade ± 5nm, e os LEDs brancos (para aquisição de imagens de refletância), da marca Cree com potencia de 10W e temperatura de cor de 3050K. Esses LEDs são alimentados por uma fonte de tensão de 10
Volts, e estão fixados a um suporte metálico com disposição adequada para a distribuição homogênea da luz sobre as superfícies do produto.
No sistema de aquisição de imagens foi utilizada uma câmera CCD científica da marca mvBlueFox 223G (Matrix Vision, Alemanha), com resolução de 1360 x 1024 pixels na área ativada do sensor e um sistema de lentes de 25mm da marca Edmund Optics, além de uma roda de filtros motorizada da marca Thorlabs, modelo FW102C com capacidade para 6 filtros, onde eram colocados os filtros com os comprimento de onda de interesse, entre 480 a 710nm (comprimento de onda do azul ao vermelho).
Para realização da aquisição das imagens espectrais, foi desenvolvido um aplicativo de supervisão e controle com interface gráfica utilizando o software LabVIEW®. O software tem a funcionalidade de aquisição das imagens espectrais (aquisição das imagens, controle de iluminação, ganho da câmera CCD e tempo de exposição) como apresentado na Figura 7.
Figura 7: Sistema IHM (Interface homem máquina - supervisório) desenvolvido para monitoramento e aquisição das imagens espectrais.
O sistema de aquisição de imagens está localizado no interior de uma câmara de desidratação, construída para desidratação parcial de uvas. Este sistema foi utilizado para a coleta de imagens e para o teste de predição de sólidos solúveis durante a desidratação a baixa
temperatura. Construiu-se uma câmara frigorifica de poliestireno expandido (EPS), com dimensões de 1,35 x 1,00 x 1,70 m (C x L x A), sistema frigorifico da marca Heatcraft, modelo Euromoon (MPN008L6B) de potencia frigorifica de 552 kcal.h-1 e fluido refrigerante R404a. Internamente na câmara está instalado um ventilador centrifugo da marca Nederman, com vazão de 450 m3.h-1, garantido um fluxo de ar sobre o produto de 0,05 m³.s-1, temos também instalado um banco de resistências com potencia de 240W, controladas através de PWM (modulação por controle de pulso) (Figura 8).
Figura 8: Vistas do sistema de desidratação e aquisição de imagens. A) Vista lateral; B) Detalhe do sistema de compressão e painel elétrico e de aquisição de dados; C) Detalhe do interior do sistema: evaporador, sistema de ar-forçado e aquisição de imagens;
O sistema de aquisição de dados e controle da câmara é realizado através de um sistema da National Instruments, modelo NIrio-92, que recebe os dados de três sensores de temperatura tipo PT-100 e um sensor de umidade da marca NOVUS, modelo RHT. O esquema de instrumentação e funcionamento da câmara é descrito na Figura 9.
Figura 9: Esquema representativo do sistema de instrumentação e controle para a câmara de desidratação.
5.2.3 Procedimentos
Primeiramente, para caracterização das amostras foram realizadas as análises físico- químicas: sólidos solúveis, acidez titulável e pH dos 3 tipos de cultivares de uva, em forma de triplicata. Para isso, previamente o produto foi esmagado e separado as amostras (AOAC, 2012).
Em seguida, foi realizada a aquisição das imagens de fluorescência e refletância para cada uma das cultivares de uva. Para conseguir analisar o cacho por inteiro, a aquisição da imagem foi sistematizada de maneira que possibilitasse a resposta espectral de pelo menos 20 bagas de uvas por imagem.
Para a coleta das imagens foram utilizados comprimentos de onda entre 480 a 710nm com a intenção de obter a resposta espectral do tecido vegetal da uva em diferentes comprimentos de onda para cada uma das três excitações (sendo que para excitações de fluorescência utilizou-se o método de fluorescência estacionário), em que aborda a cor visível entre o azul e o começo do infravermelho. Dessa forma, cada variedade de uva obteve 24 imagens de cada excitação, totalizando 72 imagens para análise.
O método de aquisição das imagens foi baseado no sistema descrito por WETTWRICH (2012), que consiste em deixar o ganho da câmera CCD em 30dB (valor máximo suportado pelo sistema) e variar o tempo de exposição de modo a não saturar a imagem até o máximo de 10000ms (limite suportado pela CCD). Após este ajuste da imagem inicia-se a captura da imagem, em que primeiro excita-se o produto por dois minutos com uma das luzes de excitação, mantém a luz ligada e procede-se o ‘snapshot’ (aquisição propriamente dita). Após a captura e a imagem salva desliga-se a luz, muda o comprimento de onda através da roda de filtros e realiza uma nova aquisição. Este procedimento foi repetido para todos os comprimentos de onda e de luz de (Figura 10).
Figura 10: Esquema de aquisição de imagem espectral em uvas com cada etapa do processo
5.2.4 Análise de dados
Após a obtenção das imagens foi feito o processamento dessas imagens que consiste no conjunto de operações a serem realizadas para melhorar a visibilidade de recursos e facilitar a análise subsequente, composto por: pré-processamento, segmentação e extração de características (ZHANG et al., 2014).
Primeiramente foi feita a normalização das imagens de acordo com a curva de resposta da câmera CCD e da curva de transmissão do filtro ótico. Esta normalização consiste em multiplicar as funções de resposta de ambos os equipamentos nos comprimentos de onda em que foram adquiridas as imagens. Em seguida, aplica-se às imagens para eliminação da informação espectral e da informação do tempo de exposição, o que retira a saturação das imagens normalizadas (Equação 2, Equação 3 e Equação 4).
= × (2) ( ) = ( )( ) (3) ( ) = ( ) × ( ) (4) Onde:
E – Curva de resposta após multiplicação das curvas de resposta; Tc – Curva de resposta da CCD;
Tf – Curva de resposta do filtro ótico;
Is – Imagem com eliminação da informação espectral; I - Imagem original;
En – Função E normalizada;
Ite – Imagem com eliminação da informação do tempo de exposição; tmin – Tempo de exposição mínimo (ms);
t – Tempo de exposição no comprimento de onda especifico (ms); λ – Comprimento de onda (nm);
Após a eliminação dos efeitos da câmera CCD e dos filtros pela normalização das imagens, faz-se a segmentação. Este processamento tem por objetivo separar a imagem em estudo de acordo com áreas ou regiões de interesse para assim possibilitar a análise final do objeto (ELMASRY et al., 2012; JACKMAN; SUN, 2013).
Neste estudo a segmentação da imagem foi baseada em regiões, através do método de Otsu (DIEZMA et al., 2013; OTSU, 1979), em que se selecionam as imagens com maior diferença entre o fundo e a região de interesse nas fontes de excitação estudadas. Depois é aplicado o algoritmo de Otsu e criavam-se quatro máscaras (480-530nm, 540-590nm, 600- 660nm e 670-710nm) para cada cultivar de uva. Este método de Otsu maximiza a variância entre classes a partir do histograma, em que assume uma distribuição normal entre o fundo e a amostra, permitindo a melhor separação entre fundo e região de interesse (MIZUSHIMA; LU, 2013). Assim, com a segmentação das imagens multiplica-se a máscara binária para o intervalo de cada espectro nas imagens pré-processadas, obtendo-se assim uma imagem segmentada apenas com a região de interesse, conforme ilustrado na Figura 11.
Figura 11: Imagem segmentada para 480nm em uvas Itália com excitação de refletância.
Com a determinação da região de interesse, foi construída uma matriz coluna com os valores de pixels diferentes de zero (referentes à região da imagem que contém as cultivares de uva) para cada comprimento de onda. Em seguida, junta-se estas matrizes coluna de cada comprimento resultando em uma matriz Dataset para processamento. Nessa matriz as linhas são os valores de pixel e as colunas representam cada comprimento de onda para cada cultivar de uva (Equação 5).
= ⋮! ⋯⋱ ⋮!
% ⋯ %
& (5)
A partir do Dataset de cada cultivar de uva inicia-se o pré-processamento espectral dos dados. Para o pré-processamento espectral dos dados foi utilizado o SNV (Standard
Normal Variate) para suavizar os ruídos espectrais, deixar as amostras na mesma escala e
reduzir os efeitos ambientais e de textura das amostras, chamados de efeitos aditivos e multiplicativos (FERREIRA, 2015; MISHRA et al., 2015). Para isso, são calculadas as médias e o desvio padrão de todo o espectro. Em seguida, cada valor do Dataset é subtraído da média e divido pelo desvio padrão, para remoção do efeito de dispersão espectral, como resultado final obtém um Dataset normalizado. Após este pré-tratamento espectral, calcula-se a média e o desvio padrão de cada comprimento de onda do Dataset normalizado e determina-
se o espectro médio para cada cultivar de uva em seu respectivo comprimento de onda de excitação (fluorescência 405nm, 470nm e refletância).
A análise espectral foi feita para quantificar a diferença da resposta espectral para cada fonte de excitação no espectro visível, entre as cultivares de uva. Para isso foi realizada uma análise quimiométrica através da análise multivariada de componentes principais (PCA –
Principal Component Analysis).
A PCA trata-se de um método de análise exploratória de dados multivariados que utiliza o principio de projeção de dados n-dimensionais em um espeço de menor dimensão. Esta redução espacial é feita através das componentes principais, de modo que se determina autovetores e autovalores da matriz de covariância dos dados originais e cria-se uma matriz em que o primeiro elemento corresponde ao autovetor com maior autovalor, assim sucessivamente até o último elemento da matriz sendo o autovetor com menor valor (Equação 6). Isto ocorre para selecionar as componentes principais com a maior variância acumulada e descartar as componentes que tem menor informação dos dados em estudo (FERREIRA, 2015; WETTERICH, 2012). ' = ( × ) × (6) Onde: X – Matriz de dados; U – Autovalores; S – Autvetores; V – Matriz de loadings;
Para verificar a diferença entre as cultivares de uva estudadas em cada fonte de excitação utilizou-se o gráfico de scores, que consiste na composição das principais componentes em relação às amostras (devido sua relação de ortogonalidade) sendo possível examinar as relações entre amostras. Nos gráficos os eixos são constituídos pelas componentes principais.
Para verificar qual o comprimento de onda mais importante para representação espectral dos dados analisou-se o gráfico de loadings (peso de cada variável para o Dataset normalizado). Após esta análise foi verificado também o gráfico de resíduos para cada cultivar de uva para encontrar possíveis ruídos ou interferências nos dados espectrais.
5.2.5 Análise Estatística
Todas as análises foram realizadas no software Matlab®, através do uso das funções presentes no path PLS_Toolbox. Foi realizado a PCA sobre o Dataset normalizado, e foram analisados os gráficos de scores sobre as quatro primeiras componentes principais (pois estas sempre representaram mais de 80% das informações em análise), podendo assim verificar se há diferença entre as variedades de uva para cada excitação.
5.3 2º Experimento
O objetivo do segundo experimento foi correlacionar os dados espectrais e a variável físico-química de sólidos solúveis em uvas frescas e desidratadas parcialmente, com o uso de regressão multivariada através de imagens espectrais de refletância e fluorescência (com excitação de 405nm e 470nm) no espectro UV-VIS (ultravioleta e visível).
5.3.1 Unidades Experimentais
Foram utilizadas uvas somente a cultivar Itália (uvas brancas) devido ao alto contraste obtido na imagem, como ilustrado na Figura 12. Foram utilizadas amostras frescas e desidratadas. As amostras desidratadas foram submetidas à desidratação parcial por vinte quatro horas (24h) em estufa de circulação de ar forçado a 65ºC, para posterior análise, modelamento, e teste de predição de sólidos solúveis durante a desidratação em câmara a 37ºC por 24 horas.
5.3.2 Instrumentação
As análises físico-químicas foram feitas através das medidas de sólidos solúveis, e foi acrescentada a análise do teor de água, pois o experimento avaliar uvas frescas e desidratadas parcialmente.
O teor de água foi determinado através do método de gravimetria. Neste método utilizaram-se amostras aleatórias de bagas com massa total de amostra variando entre 10 e 25g, sendo acondicionadas em cápsulas metálicas previamente taradas. As amostras permaneceram em estufa a 65°C, sendo retiradas e resfriadas em dessecador até atingir a temperatura ambiente. Esse processo foi repetido até a obtenção de massa constante do produto. Com a massa final do produto seco, o teor de água do produto é calculado através da diferença de massa e expressa em porcentagem em base úmida.
Para a desidratação parcial das amostras foi utilizada uma estufa de circulação de ar, as amostras foram pesadas com auxílio de balança analítica digital (marca Gehaka, modelo BG4000, faixa de medida de 4200 g, erro de ± 0,01 g.ºC-1 e precisão de 0,01g) e o valor obtido foi submetido à Equação 7:
%U,- = ./
.0 × 100 (7) Onde:
%Ubs = Teor de água em base seca (%);
mw = Massa de água da amostra (g);
mt = Massa total da amostra (g).
O sistema de aquisição de imagens espectrais de refletância e de fluorescência utilizado também foi o mesmo descrito no primeiro experimento.
5.3.3 Procedimentos
Neste experimento, por tratar-se de apenas da cultivar Itália, foram tiradas bagas de acordo com ARAÚJO et al. (2009), para caracterizar a amostra por meio das análises físico- químicas: com 75 repetições de sólidos solúveis e 3 repetições de teor de água, de forma
triplicata para cada tratamento. Previamente as análises o produto foi esmagado e separado as amostras(AOAC, 2012).
Em seguida, foi realizada a aquisição das imagens de fluorescência e refletância para cada uma das cultivares de uva. Para conseguir analisar o cacho por inteiro, a aquisição da imagem foi sistematizada de maneira que possibilitasse a resposta espectral de pelo menos 20 bagas de uvas por imagem. O procedimento de aquisição das imagens ocorreu em três etapas: 1) aquisitar imagens com as uvas frescas, 2) aquisitar imagens com as uvas parcialmente desidratadas e 3) aquisitar imagens para os comprimentos de onda selecionados durante o processo de desidratação em câmara, conforme descrito na Figura 13.
Figura 13: Esquema do processo de aquisição de imagem espectral em uvas cv. Itália.
Foram coletas imagens entre os comprimentos de onda de 480nm a 710nm, com a finalidade de se avaliar a resposta espectral de uvas da cv. Itália, frescas e parcialmente desidratadas em diferentes comprimentos de onda para cada uma das 3 excitações, em que aborda espectro visível entre o azul e o começo do infravermelho. Assim, cada cultivar de uva e cada tratamento obteve 24 imagens de cada excitação, totalizando 72 imagens para análise.
O método de aquisição utilizado foi o mesmo descrito no primeiro experimento.
5.3.4 Análise de dados
A forma utilizada para o processamento das imagens é a mesma utilizada no primeiro experimento, em que foi realizado: pré-processamento, segmentação e extração de características em ambos os tratamentos (fresca e desidratada parcialmente). Primeiramente foi realizada a normalização das imagens. Na segmentação foi retirada apenas a região de interesse e comprimentos de onda, como resultado foi criada a matriz Dataset para cada tratamento e a partir deste Dataset realizou-se o pré-processamento espectral dos dados por
meio do SNV, transformando em Dataset normalizado. A análise espectral também foi realizada através da análise multivariada de componentes principais (PCA). No caso do segundo experimento, o gráfico de scores foi utilizado para verificar a diferença entre os tratamentos em cada fonte de excitação, e assim verificar a possibilidade de aplicação de um processo de calibração multivariada com objetivo de predição de valores de sólidos solúveis.
Para a análise do segundo experimento, o Dataset normalizado sofreu uma redução devido ao tamanho das amostras obtidas nas imagens, esta redução teve por objetivo acondicionar os dados para posterior calibração multivariada. Através de uma redução pela média reduziu os dados em um Dataset de 74 amostras por tratamento.
5.3.5 Análise Estatística
Como no primeiro experimento todas as análises foram realizadas no software Matlab®, através do uso das funções presentes no path PLS_Toolbox. Foi realizado a PCA sobre o Dataset normalizado, e foram analisados os gráficos de scores sobre as duas primeiras componentes principais (pois estas sempre representaram mais de 95% das informações em análise), podendo assim verificar se há diferença entre os dois tratamentos para cada excitação.
A calibração multivariada é definida como um método quantitativo de analise, relacionando matematicamente a resposta de um instrumento com uma ou mais propriedades de interesse. Assim constrói-se um modelo que possibilita esta medida, a calibração multivariada relaciona um conjunto de amostras com um conjunto de respostas (FERREIRA, 2015). O principio é relacionar dois blocos de dados, em que o bloco dos dados experimentais é composto pelas variáveis independentes (amostras e variáveis) e o outro bloco é formado pelas variáveis dependentes, são então utilizadas múltiplas respostas na regressão a ser elaborada. Ela é divida em duas etapas (modelagem e calibração), os métodos de regressão multivariados mais utilizados em análise espectral quantitativa são MLR (regressão multilinear), PCR (regressão por componentes principais) e PLSR (regressão pelo método dos mínimos quadrados) (ELMASRY et al., 2012; FERREIRA, 2015; FERREIRA et al., 1999).
Neste experimento utilizou-se o método PCR, pois trata-se de um método simples de implementar matematicamente. O PCR é um método que consiste de duas etapas uma PCA seguida por uma MLR entre a propriedade e amostra, usando componentes principais selecionadas. Segundo NICOLAÏ et al. (2007), deve-se tentar para os componentes que são os mais informativos para obtenção da regressão final, pois muitas vezes as primeiras