Adhésion et cytotoxicité de Pseudomonas fluorescens sur l’intestin, potentiel inflammatoire et voies de signalisation associées (Article 1, Madi et al, 2010a), Figure 8

L’adhésion sur les cellules épithéliales intestinales étant une étape cruciale dans les processus infectieux, nous avons étudié le potentiel d’adhésion de P. fluorescens sur les lignées intestinales Caco-2/TC7 et HT-29. Dans le cadre de la thèse d’Amar Madi, que j’ai encadré avec le Pr Marc Feuilloley, nous avons pu montrer que la souche environnementale psychrotrophe P. fluorescens MF37 et la souche clinique P. fluorescens MFN1032 sont capables d’adhérer de façon similaire aux cellules Caco-2/TC7. Au contraire sur le modèle cellulaire HT29 qui sécrète plus de mucus, l’adhésion était plus élevée pour P. fluorescens MFN1032 que pour P. fluorescens MF37. La cytotoxicité sur ces cellules a également été étudiée, et a montré un pouvoir cytotoxique dose-dépendante et souche-dépendante, avec une mortalité cellulaire maximale de 30% après 24 h d’infection des cellules Caco-2/TC7 avec

P. fluorescens MF37 et une mortalité cellulaire maximale de 70% dans le cas de la souche

clinique P. fluorescens MFN1032. Ces résultats nous ont permis de conclure que P.

fluorescens MFN1032 a un comportement qui se rapproche de P. aeruginosa PAO1, un

pathogène opportuniste bien caractérisé. Les deux souches de P. fluorescens étudiés étaient capables d’induire la production d’interleukine-8 (IL-8) chez les cellules Caco-2/TC7 et HT-29 montrant donc aussi un potentiel pro-inflammatoire non négligeable.

L’expression du gène IL-8 est régulée principalement par les facteurs de transcription NF-κB et AP-1 (dépendant de la voie des MAPK). En collaboration avec le Dr Hervé Blottière de l’INRA de Jouy en Josas, nous avons donc recherché la voie de signalisation qui est activée par ces bactéries et nous avons pu montrer que dans nos conditions expérimentales celles-ci activaient la voie de signalisation AP-1 des MAPK et n’activaient pas la voie NF-κB (Figure 8) contrairement à P. aeruginosa PAO1. Les MAPK sont connues pour être impliquée notamment dans l’infection de certaines bactéries invasives comme Salmonella enterica serovar typhimurium ou Listeria monocytogenes dans les cellules épithéliales intestinales (Hobbie et al, 1997 ; Tang et al, 1998) ou dans les macrophages (Schwan et al, 1996).

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Figure 8 : Adhésion et cytotoxicité de Pseudomonas fluorescens sur les cellules de l’intestin,

potentiel inflammatoire et voies de signalisation associées (schéma simplifié)

(Article 1, Madi et al, 2010a)

Madi A, Lakhdari O, Blottière HM, Guyard-Nicodème M, Le Roux K, Groboillot A, Svinareff P, Doré J, Orange N, Feuilloley MG, Connil N (2010). The clinical Pseudomonas fluorescens MFN1032 strain exerts a cytotoxic effect on epithelial intestinal cells and induces Interleukin-8 via the AP-1 signaling pathway. BMC Microbiol. 10:215.

Adhésion MAPK AP1 _NFκB Cytotoxicité Dose dépendante et souche dépendante LDH IL-8 Inflammation Pseudomonas fluorescens Cellules intestinales

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B) Invasion et translocation de Pseudomonas fluorescens. Effet sur la résistance transépithéliale (TER) et le cytosquelette d’actine F (Article 2, Madi et al, 2010b) Figure 9

Toujours dans le cadre de la thèse d’Amar Madi, nous avons étudié l’effet de P. fluorescens sur des cellules Caco-2/TC7 cultivées sur inserts de culture pendant 21 jours, un modèle de cellules différenciées qui se rapproche plus des entérocytes de l’intestin que celui utilisé précédemment. Nous avons pu ainsi montrer que P. fluorescens diminue la résistance transépithéliale (TER) de la monocouche de cellules Caco-2/TC7 d’environ 20% après 24 h d’infection. La diminution de la TER était associée à une augmentation de la perméabilité des cellules Caco-2/TC7 (Figure 9), celle-ci a été mesurée par le passage de billes de FITC-dextran 4 kDa du compartiment apical vers le compartiment basolatéral.

Le marquage de l’actine F avec de la phalloïdine couplée à l’Alexa-488 a permis d’observer une réorganisation du cytosquelette. Le cytosquelette d’actine F est intimement lié aux protéines des jonctions serrées qui participent dans la régulation de la perméabilité paracellulaire, Nous avons donc recherché si l’expression des gènes ZO-1, occludine et claudine-1, qui codent pour certaines protéines des jonctions serrées, est modifiée suite à l’infection par P. fluorescens. Les résultats ont montré que l’expression des gènes ZO-1 et occludine augmente de façon non significative 4 h après l’infection avec P. fluorescens mais que l’expression de claudine-1 était diminuée. L’infection de cellules Caco-2 avec E. coli entero-invasive conduit également à une diminution de la claudine-1 et à une baisse de la TER (Qin et al, 2009).

La capacité de translocation de P. fluorescens a été évaluée après 6 h d’infection et a montré que ces bactéries sont capables de traverser la couche de cellules Caco-2/TC7 (Figure 9). Ceci pourrait permettre d’expliquer au moins en partie comment l’antigène I2 spécifique de

P. fluorescens est retrouvé dans le sérum de certains patients atteints de la maladie de

Crohn. Notre étude a montré aussi que P. fluorescens présente un comportement invasif plus important vis-à-vis de cellules Caco-2/TC7 différenciées cultivées sur inserts que dans le cas de cellules confluentes indifférenciées cultivées sur plaques.

Alors qu’une lyse cellulaire importante avait pu être observée, lorsque des cellules cultivées sur plaques étaient infectées par P. fluorescens, aucune cytotoxicité n’a été détectée de façon significative lors de l’infection des cellules différenciées par P. fluorescens.

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Figure 9 : Invasion et translocation de Pseudomonas fluorescens dans l’intestin. Effet sur la

résistance transépithéliale et le cytosquelette d’actine F (schéma simplifié)

(Article 2, Madi et al, 2010b)

Madi A, Svinareff P, Orange N, Feuilloley MG, Connil N (2010). Pseudomonas fluorescens alters epithelial permeability and translocates across Caco-2/TC7 intestinal cells. Gut Pathog. 2(1):16.

Translocation bactérienne Pseudomonas fluorescens Cellules intestinales différenciées ^Invasion LUMIERE INTESTINALE Perméabilité TER Modification du cytosquelette (Actine F)

Réorganisation du cytosquelette d’actine F des cellules infectées avec

P. fluorescens MFN1032

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Au contraire, P. aeruginosa entraine une lyse cellulaire sur les cellules différenciées, et même si celle-ci reste plus modérée que dans le cas de cellules cultivées sur plaques, elle pourrait permettre d’expliquer la baisse plus forte de la TER avec cette bactérie. Les cellules intestinales peuvent avoir une réponse variable à l’infection en fonction de leur niveau de différenciation. En effet, il a été montré précédemment, que la différenciation et la polarisation de la barrière épithéliale augmentent la résistance de ces cellules vis-à-vis d’une infection par Pseudomonas (Kazmierczak et al, 2004).

C) Lactobacillus salivarius SMXD51, un probiotique potentiel qui peut réduire les effets