Unité I
Procédés de séparation et techniques de chromatographie
Résumé de l’activité d’apprentissage
À la fin de cette unité, les lecteurs seront capables de :
• Réintégrer les méthodes de séparation enseignées à l’école • Expliquer les principes de base de l’extraction au solvant
• Résoudre des problèmes numériques hypothétiques concernant l’extraction au solvant
• Nommer et dessiner les appareils utilisés pour l’extraction au solvant • Nommer les techniques courantes de chromatographie sur colonne et
chro-matographie planaire.
• Expliquer la théorie sous-tendant chacune des techniques de chromatographie planaire et sur colonne
• Rappeler l’équipement nécessaire pour la chromatographie planaire et sur colonne
Liste des lectures obligatoires Procédés de séparation http://en.wikipedia.org/wiki/Separation_process http://en.wikipedia.org/wiki/Distillation#Laboratory_scale_distillation http://en.wikipedia.org/wiki/Liquid-liquid_extraction http://en.wikipedia.org/wiki/Separating_funnel http://en.wikipedia.org/wiki/Distillation Chromatographie http://en.wikipedia.org/wiki/HPLC http://en.wikipedia.org/wiki/Chromatography http://hplc.chem.shu.edu/HPLC/index.html http://www.waters.com/watersdivision/ContentD.asp?watersit=JDRS-5LTGBH http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/column.html#top
Liste de liens utiles pertinents http://www.chromatography-online.org/Principles/Introduction/rs1.html http://antoine.frostburg.edu/chem/senese/101/matter/chromatography.shtml http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatogrmenu.html#top http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/thinlayer.html#top http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/be_types.htm http://www.forumsci.co.il/HPLC/modes/modes3.htm http://www.chem.ubc.ca/courseware/121/tutorials/exp3A/columnchrom/ http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/chrom/gaschrm2.htm Procédés de séparation Extraction au solvant
L’extraction liquide-liquide, aussi connue sous le nom d’extraction au solvant (ou plus rarement, extraction par partage), est une méthode de séparation des compo-sés basée sur leur solubilité relative dans deux liquides différents non-miscibles, habituellement l’eau et un solvant organique. C’est une extraction d’une substance d’une phase liquide dans une autre phase liquide. Dans cette méthode, une solution (généralement aqueuse) contenant un ou des soluté(s) est mise en contact avec un solvant (généralement organique) dans le but de transférer un soluté (ou plus) de la solution aqueuse vers le solvant. Le mélange est agité vigoureusement afin d’augmen-ter l’entrée en contact des particules de la solution avec celles du solvant, on utilise généralement une ampoule à décantation pour cette opération. L’appareil est ensuite laissé au repos afin de permettre aux deux phases de se séparer.
Coefficient de partage
Le coefficient de partage ou de distribution (K) est le rapport des concentrations d’un composé (ou soluté) dans les deux phases d’un mélange de deux solvants non-miscibles à l’équilibre. Ce coefficient est une mesure de la différence de solubilité du composé entre les deux solvants présents.
Normalement, un des solvants choisis est l’eau (ou une solution aqueuse), et le se-cond est un solvant organique (donc hydrophobe), comme l’octanol, par exemple. Ainsi, les coefficients de partage et de distribution sont en quelque sorte une mesure de l’hydrophilie (affinité ave l’eau) ou de l’hydrophobie (incompatibilité avec l’eau) d’une substance chimique.
Facteurs influençant l’extraction au solvant
La polarité du soluté et la polarité du solvant : en général, les composés polaires seront dissous dans les solvants polaires et les solutés non-polaires se retrouveront dans le solvant organique, à moins que celui-ci ne contienne un nombre suffisant de groupes fonctionnels hydrophiles tels que les groupements hydroxyles ou sulfoniques. Généralement, on ne pourra extraire les composés ioniques à l’aide d’un liquide or-ganique. Ceux-ci pourront être extraits en les faisant réagir avec des agents chélatants (ou complexants) afin de former de grosses entités non-polaires.
Distillation
Les distillations opérées à l’échelle du laboratoire sont presque exclusivement des distillations discontinues, c’est-à-dire que l’on distille complètement le mélange en ses composés avant de recharger l’appareil avec le même mélange, et l’on répète le processus. L’appareil utilisé, souvent appelé distillerie, est minimal est consiste en une sorte de bouilloire, un bouilleur, dans lequel le liquide de départ est chauffé; un condensateur (ou réfrigérant) dans lequel la vapeur est refroidie et revient à l’état liquide; puis un réceptacle où le liquide purifié concentré (appelé distillat) est recueilli. Il existe plusieurs techniques pour la distillation en laboratoire.
Distillation simple
Dans la distillation simple, toutes les vapeurs chaudes produites sont immédiatement canalisées dans le condensateur qui refroidit et condense les vapeurs. Par contre, le distillat ne sera pas pur ; sa composition sera identique à la composition de la vapeur à une température et à une pression données, et peut être déterminée par la loi de Raoult.
La distillation simple est donc utilisée uniquement pour séparer des liquides dont les points d’ébullition diffèrent significativement (d’au moins 25°C selon la recom-mandation) ou encore pour séparer des liquides d’avec des solides non volatiles ou des huiles. Dans ces cas, les pressions de vapeur des composants sont généralement suffisamment différentes pour que l’on puisse négliger les effets relatifs à la loi de Raoult, ceci étant attribuable au fait que les composantes non volatiles contribuent peu à la vapeur. Toujours dans ce cas et selon l’utilisation visée, le distillat obtenu pourrait être suffisamment pur.
Distillation fractionnée
Dans plusieurs cas, les points d’ébullition des composantes du mélange seront trop proches l’un de l’autre. On doit alors utiliser la distillation fractionnée afin de séparer adéquatement les composés. Ceci se fera à l’aide de cycles répétés de vaporisation-condensation à l’intérieur d’une colonne Vigreux.
Figure 1 : Appareil de distillation fractionnée. (Schéma modifié) Référence : http://en.wikipedia.org/wiki/Fractional_distillation
Comment la distillation fractionnée fonctionne-t-elle ?
À mesure que la solution à purifier est chauffée, la vapeur s’élève dans la colonne de fractionnement. Lors de l’élévation de la vapeur, celle-ci se refroidit, se condensant sur les parois du réfrigérant et à la surface du matériau de garnissage. Ici, le condensat continue à être chauffé par les vapeurs chaudes qui s’élèvent, et il se vaporise une fois de plus. La composition des nouvelles vapeurs est toutefois déterminée par la loi de Raoult. Chaque cycle de vaporisation-condensation (appelé plateau théorique) donnera une plus pure solution du composé le plus volatile. En réalité, chaque cycle à une température donnée n’a pas lieu à la même position exactement dans la colonne à fractionner, le plateau théorique est donc plus un concept qu’une réalité concrète. Plus on augmente le nombre de plateaux théoriques, meilleure est la séparation. Le garnissage se trouvant à l’intérieur de la colonne de fractionnement a cette utilité. Il est souvent constitué d’un système d’anneaux vrillés, faits de téflon ou de métal, ce afin d’augmenter la surface de contact entre la vapeur et le condensat liquide. Ceci améliore les échanges entre les phases pour un volume de colonne donné et permet ainsi d’augmenter le nombre de plateaux théoriques.
Hydrodistillation ou Entraînement à la vapeur
Figure 2 : Hydrodistillation. Référence : http://en.wikipedia.org/wiki/Steam_dis-tillation (dernier accès en mars 2008).(Schéma modifié)
Comment l’hydrodistillation fonctionne-t-elle ?
L’hydrodistillation, aussi appelée entraînement à la vapeur, est une méthode servant à distiller des composés sensibles à la chaleur. Ce procédé implique l’utilisation de vapeur surchauffée (ou vapeur vive) qui sera injectée dans le liquide brut (le liquide organique à distiller). Selon la loi de Raoult, certains des composés ciblés vont s’évaporer, en accord avec leur pression partielle. Le mélange de vapeur est refroidi et condensé, et généralement on obtiendra une couche huileuse ou organique ainsi qu’une couche aqueuse.
Distillation sous pression réduite
Figure 3 : Appareil de distillation sous pression réduite
Certains composés ont de très hauts points d’ébullition. Pour amener ces composés au point d’ébullition, il est souvent préférable de réduire la pression plutôt que d’augmen-ter la température. Une fois la pression abaissée à la pression de vapeur du composé (à une température donnée), l’ébullition ainsi que le reste du processus de distillation peut débuter. Cette technique fait référence à la distillation sous pression réduite et ce procédé est souvent opéré en laboratoire à l’aide d’un évaporateur rotatif.
La distillation sous pression réduite est utile pour les mélanges qui ont un point d’ébullition plus élevée que leur température de décomposition à la pression atmos-phérique et qui se décomposeraient si l’on tente de les amener à ébullition sans avoir au préalable abaissé la pression.
Chromatographie
Théorie sur la chromatographie
La chromatographie est un procédé de séparation basé sur les différences d’affinité des substances à analyser à l’égard de deux phases, une phase stationnaire et une phase mobile.
Ces composantes contenues dans la phase stationnaire sont retenues plus longtemps dans le système que celles qui sont distribuées sélectivement dans la phase mobile. En conséquence, les solutés sont élués du système à différents temps, selon l’ordre croissant de leurs coefficients de distribution dépendamment de la phase stationnaire ; c’est de cette façon que la séparation s’accomplit.
Les échantillons peuvent être de nature gazeuse, liquide ou solide et peuvent varier de simple mélange de deux énantiomères à mélange complexe contenant plusieurs substances chimiques de types très différents. Qui plus est, l’analyse peut être faite moyennant des coûts très élevés et une instrumentation complexe ou encore très simplement sur une plaque de couche mince très peu coûteuse. La chromatographie constitue le fondement d’un très grand nombre de techniques analytiques. Cette partie du module présente les techniques chromatographiques les plus courantes et leurs applications.
Le processus d’entraînement
L’entraînement (ou développement du chromatogramme) est le terme utilisé pour décrire la façon dont les composantes d’un mélange sont séparées durant le procédé chromatographique. Il y a trois méthodes de base : le développement frontal, le développement par déplacement, et l’élution. La plupart des développements chro-matographiques analytiques se font par élution.
Processus d’élution
L’élution peut être décrite telle qu’une série de processus d’absorption-extraction continus à partir du moment où l’échantillon est injecté ou déposé dans le système chromatographique jusqu’au temps où le soluté en est extrait. Le processus d’élution est illustré dans la figure représentée ci-dessous.
Figure 4 : Le processus d’élution.
À mesure que le soluté pénètre dans la phase mobile du système chromatographique, sa concentration s’accroît et devient supérieure à la limite requise (concentration d’équilibre) à la le soluté passe dans la phase stationnaire. Le soluté commence im-médiatement à entrer dans la phase stationnaire. Le soluté commence imim-médiatement à entrer dans la phase stationnaire. Puisque la quantité de phase mobile atteint la phase stationnaire augmente régulièrement alors la concentration en soluté de cette dernière augmente jusqu‘à atteindre la concentration d’équilibre et commencera à désorber, c’est-à-dire retourner dans la phase mobile. De là, le soluté sera entraîné plus loin dans (ou sur) la phase stationnaire.
La phase mobile va continuellement faire progresser le profil de concentration du soluté dans la phase stationnaire, les concentrations dans les deux phases étant constamment en relation. Ceci est illustré grossièrement en figure 4.
Ce déplacement amène la concentration du soluté de la phase mobile au devant du pic (fig. 4) à excéder la concentration d’équilibre requise dans la phase stationnaire. En conséquence, une bonne quantité de soluté dans la partie avant du pic (voir figure 4) sort de la phase mobile et pénètre continuellement la phase stationnaire, tentant de rétablir l’équilibre. À l’arrière du pic (fig. 4), c’est la réaction inverse qui se pro-duit : à mesure que le profil de concentration de soluté progresse, la concentration de soluté dans phase stationnaire à l’arrière du pic devient en excès par rapport à la concentration à l’équilibre.
Une quantité de soluté doit alors quitter la phase stationnaire et entrer dans la phase mobile afin de rétablir l’équilibre. Ainsi, le soluté progresse à travers le système chromatographique, suite à l’entrée de soluté dans la phase mobile à l’arrière du pic et à son retour dans la phase stationnaire à l’avant du pic. Le soluté est toutefois toujours en transfert entre les deux phases à travers le pic entier, tentant sans cesse d’atteindre ou de maintenir l’équilibre thermodynamique.
En résumé, la bande de soluté progresse à travers le système chromatographique suite à un transfert net de soluté de la phase mobile dans la phase stationnaire dans la moitié avant du pic. Ce transfert net de soluté est compensé par le passage de soluté de la phase stationnaire jusqu’à la phase mobile dans la moitié arrière du pic.
Efficacité de la séparation chromatographique
La distribution des analytes (A) entre les phases peut être décrite de façon assez simple. Un analyte (soluté) est en équilibre entre les deux phases :
APhase mobile APhase stationnaire
La constante d’équilibre, K, est appelé le coefficient de partage. Il se définit comme étant le rapport de la concentration molaire de l’analyte dans la phase stationnaire sur la concentration molaire de l’analyte dans la phase mobile.
Le temps entre l’injection de l’échantillon dans le système et l’atteinte du détecteur par le pic d’analyte est appelé temps de rétention (tr). Chaque soluté ou analyte contenu dans l’échantillon injecté aura un temps de rétention différent. Le temps nécessaire à la phase mobile pour passer à travers la colonne est appelé temps mort (tm).
Figure 5 : Les concepts de temps de rétention et de temps mort
Une variable appelée facteur de rétention (parfois appelé facteur de capacité), k’, est souvent utilisée pour décrire le taux de migration d’un analyte sur une colonne. k’ varie avec la force d’élution du solvant; quand celle-ci augmente, k’ diminue. Le facteur de rétention de l’analyte A est défini comme suit : k’A = (t r – tm) / tm
Les constantes t r et tm sont obtenues facilement à partir du chromatogramme. Lorsque le facteur de rétention d’un analyte est inférieur à 1, alors l’élution est si rapide que la détermination du temps de rétention est très difficile. Les facteurs de rétention élevés (supérieurs à 20), indiquent une élution très longue. Idéalement, le facteur de rétention pour un analyte se situe entre 1 et 5.
La quantité α, appelée facteur de sélectivité, décrit la séparation de deux substances (A et B) sur la colonne : α = k ‘B / k ‘A
Lors du calcul de α, l’analyte A élue plus rapidement que l’analyte B. Le facteur de sélectivité α est toujours supérieur à 1.
Élargissement des pics et efficacité de colonne
Pour une séparation optimale, l’obtention de pics nets (effilés) et symétriques est nécessaire. Cela signifie que les causes de l’élargissement des pics doivent être mi-nimisées le maximum possible.
Modèle des plateaux théoriques en chromatographie
Le modèle des plateaux théoriques suppose que la colonne chromatographique contienne un grand nombre de niveaux distincts, on les appelle plateaux théoriques. Les équilibrations de l’échantillon séparées entre les deux phases mobile et stationnaire se produit sur ces plateaux. L’analyte traverse la colonne par transfert de la phase mobile à l’équilibre d’un plateau à l’autre.
Figure 6 : Le concept des plateaux théoriques
Les plateaux de la colonne sont un concept théorique pour la mesure de l’efficacité de la colonne, soit en établissant le nombre de plateaux d’une colonne, N (plus il y a de plateaux, mieux c’est), ou la hauteur d’un plateau (la hauteur équivalent à un plateau théorique, HEPT), (plus la hauteur est petite, mieux c’est).
Si la longueur de la colonne est définie comme L, alors la HEPT est : HEPT = L/N
Le nombre de plateaux théoriques réellement contenus dans une colonne peut être trouvé en examinant le pic chromatographique après l’élution :
Où w1/2 correspond à la largeur du pic à mi-hauteur.
Tel que suggéré par l’équation ci-dessus, les colonnes se comportent comme si leur nombre de plateaux théoriques changeait en fonction des différents solutés d’un mélange.
Théorie dynamique de la chromatographie
Voici une description plus réaliste du processus s’opérant à l’intérieur de la colonne qui prend en compte le temps nécessaire au soluté pour atteindre l’équilibre entre les phases mobile et stationnaire (contrairement au modèle des plateaux théoriques qui assume que l’arrivée à l’équilibre est infiniment rapide). La forme du pic chro-matographique résultant est ainsi affectée par la rapidité d’élution. La forme du pic est également influencée par le fait que plusieurs chemins différents peuvent être empruntés par les molécules de soluté lorsqu’elles progressent entre les particules de la phase stationnaire. Si l’on considère les nombreux phénomènes contribuant à l’élargissement des pics, on obtient l’équation de Van Deemter pour la hauteur des plateaux :
HETP = A + B / u + C u
Où u est la vitesse moyenne de la phase mobile. A, B, et C sont trois facteurs qui contribuent à l’élargissement des pics ; ils sont expliqués ci-dessous.
A – Diffusion d’Eddy ou diffusion turbulente
La phase mobile progresse dans la colonne remplie de phase stationnaire. Les molécu-les de soluté prendront différents chemins au hasard à travers molécu-les particumolécu-les contenues dans la phase stationnaire. Puisque les différents chemins empruntés seront de lon-gueurs variables, cela occasionnera un élargissement du pic chromatographique. B – Diffusion longitudinale
À cause du flux chromatographique, la concentration de l’analyte est moindre sur les bords de la colonne qu’en son centre, de même que les particules au centre du flux chromatographique progressent plus rapidement. L’analyte diffuse du centre vers les côtés, ce qui cause un élargissement du pic. Lorsque la vitesse de la phase mobile est élevée, alors l’analyte reste moins longtemps sur la colonne et cela diminue l’effet de diffusion longitudinale.
C - Résistance au transfert de masse
L’analyte prend un certain temps pour arriver à l’équilibre entre la phase mobile et la phase stationnaire. Si la vitesse de la phase mobile est élevée et que l’analyte a une forte affinité pour la phase stationnaire, alors la phase mobile va se placer au devant de l’analyte à l’intérieur de la phase stationnaire. Le pic chromatographique de cet analyte s’en trouvera élargi. Plus la vitesse de la phase mobile est élevée, moins les molécules peuvent pénétrer dans la phase stationnaire. Dans ce cas, l’équilibre n’est pas favorisé, la colonne devient moins performante et l’élargissement du pic augmentera.
Courbe de Van Deemter
Voici un graphique illustrant la relation entre la hauteur du plateau théorique versus la vitesse moyenne linéaire de la phase mobile :
Figure 7 : Graphique de la Courbe de Van Deemter
Des courbes comme celles-ci sont d’une grande utilité pour déterminer la vitesse optimale de flux de la phase mobile.
Résolution
Même si le facteur de sélectivité α décrit la séparation des centres des pics, il ne tient pas compte de la largeur de ces pics. La mesure de la résolution est une autre mesure de la bonne séparation des pics. La résolution de deux pics de solutés, A et B, est définie ainsi :
La résolution de ligne de base est atteinte lorsque R = 1,5.
Il est utile de faire le lien entre la résolution, le nombre de plateaux théoriques de la colonne, le facteur de sélectivité et le facteur de rétention de deux solutés :
Afin d’obtenir une haute résolution, les trois variables doivent être maximisées. Une augmentation de N (nombre de plateaux théoriques), en allongeant la colonne mène à une augmentation du temps de rétention et un élargissement du pic – qui n’est pas souhaitable. À la place, afin d’augmenter le nombre de plateaux théoriques, la hauteur équivalente au plateau théorique (HEPT) peut être réduite en diminuant la taille des particules de la phase stationnaire.
On remarque souvent que, en contrôlant le facteur de capacité k’, la séparation peut être grandement améliorée. Cela peut être accompli en modifiant la température (en chromatographie gazeuse), ou alors la composition de la phase mobile (en chroma-tographie liquide).
Le facteur de sélectivité α peut aussi être manipulé afin d’améliorer la séparation. Lorsque α est près de 1, l’optimisation de k’ et l’augmentation de N ne sont pas