A- La gallocine est une bactériocine de classe IIb (à deux peptides)
Les gènes codant pour les peptides constituant la gallocine (anciennement annoté
gallo_2020 et gallo_2021) avaient été nommés blpA et blpB par Aymeric et al. (2018). Dans
ce travail, ils ont été renommés gllA1 et gllA2 (Figure 20A) pour reprendre la nomenclature
utilisée dans une publication récente qui décrit l’existence d’un nouveau variant de la gallocine
appelée gallocine D (Hill et al., 2020). Le mutant construit initialement par Aymeric et al.,
appelé Dblp, est délété pour les 3 gènes gllA1, gllA2 et gip et ne possède plus d’activité
antibactérienne contre Sgm (Figure 20A et B) (Aymeric et al., 2018).
Les peptides codés par les gènes gllA1 et gllA2 présentent les caractéristiques des
bactériocines de classe IIb avec un peptide leader de type double glycine et des motifs GxxxG dans les peptides matures (Figure 20C). Cependant, contrairement à d’autres bactériocines, ils contiennent très peu d’acides aminés chargés positivement.
Les bactériocines de classe IIb par définition sont constituées de deux peptides inactifs seuls et actifs une fois combinés dans un ratio 1/1. Afin de vérifier que la gallocine est une
bactériocine de classe IIb, les mutants individuels des gènes gllA1 et gllA2 ont été construits
dans la souche Sgg UCN34 en effectuant des délétions en phase dans cet opéron (DgllA1 et
DgllA2). La capacité à produire la gallocine de ces deux mutants a été testée par la méthode de
diffusion sur gélose contre la souche Sgm. Nous avons ainsi confirmé que la gallocine est une
bactériocine de classe IIb puisque les surnageants de Sgg DgllA1 et DgllA2 ne possèdent plus
d’activité gallocine lorsqu’ils sont seuls mais redeviennent actifs une fois combinés (Figure
20B). Nous avons également essayé de combiner les surnageants de DgllA1 et DgllA2 dans
différentes proportions mais l’activité optimale été observée lorsque la même quantité des deux surnageants a été ajoutée, suggérant que le ratio optimal est de 1 pour 1.
B- La gallocine est active contre les streptocoques, les entérocoques, les lactocoques et les
pédiocoques
Figure 21 : Test de la sensibilité à la gallocine de diverses bactéries
La sensibilité à la gallocine a été déterminée par le test de diffusion sur gélose. Les souches indiquées en haut sont
toutes sensibles à la gallocine (sauf Sgg qui est utilisé en contrôle) tandis que les souches indiquées en bas y sont
Comme la majorité des bactériocines, la gallocine inhibe la croissance de bactéries
phylogénétiquement proches de Sgg. Elle est active contre divers Streptocoques, Entérocoques
et Lactocoques ainsi que contre une bactérie du genre Pediococcus. Les bactéries à
Gram-positif d’espèces plus éloignées (Lactobacillus, Listeria, Bacillus,Staphylococcus, Aerococcus
et Corynebacterium) ainsi que celles à Gram-négatif (Escherichia, Pseudomonas) ne sont pas sensibles à la gallocine.
Parmi les bactéries sensibles, la taille du halo d’inhibition observé est variable, suggérant que la sensibilité à la gallocine varie selon les espèces bactériennes. On observe notamment une
différence entre les halos obtenus avec les trois souches différentes de Streptococcus agalactiae
dont l’une se révèle très sensible (A909), une autre sensible (BM110) et une peu sensible (NEM316) à la gallocine.
C- La gallocine contient des ponts disulfures et est résistante à la chaleur et au pH.
Les peptides matures GllA1 et GllA2 constituant la gallocine contiennent chacun deux résidus cystéines (Figure 20C), suggérant qu’ils pourraient former des ponts disulfures intra- ou inter-moléculaires. Le pont disulfure est une liaison covalente qui se forme par oxydation entre les atomes de soufre des fonctions thiols de deux cystéines de manière post- traductionnelle. Afin de tester l’importance des ponts disulfures potentiels dans les peptides GllA1 et GllA2 sur l’activité de la gallocine, nous avons testé l’effet de deux agents réducteurs,
le DTT (Dithiothréitol) et le b-mercaptoéthanol, qui sont capables de détruire les ponts
disulfures. L’addition de DTT (100mM) ou de b-mercaptoéthanol (70mM) au surnageant de la
souche sauvage de Sgg inhibe totalement l’activité de la gallocine (Figure 22A), ce qui suggère
que la gallocine contient effectivement des ponts disulfures essentiels à son activité. Il est
important de noter que l’existence de ces ponts disulfures a été confirmée par analyse de la masse des peptides GllA1 et GllA2 par LC/MS dans le surnageant de Sgg(Harrington et Tal-Gan, communication personnelle).
Une caractéristique importante des bactériocines de classe II est qu’elles sont souvent résistantes au pH et à une haute température (80°C, 45 min). Nous avons donc analysé la résistance de la gallocine à un choc thermique et à une large gamme de pH. Bien qu’une légère diminution de l’activité ait été observée, la gallocine est résistante à la chaleur puisqu’elle est toujours active même après avoir été chauffée pendant une heure à 80°C (Figure 22B). Elle est
Figure 22 : Résistance de la gallocine à différents stress.
Test de l’activité gallocine dans le surnageant de Sgg WT par diffusion sur gélose contre Sgm après différents
traitements physico-chimiques. A : Ajout d’agents réducteurs dans le surnageant (à droite) par rapport au surnageant non traité (à gauche). B : Surnageant chauffé à 80°C pendant 15, 30 et 60 minutes. C : Modification du pH du surnageant (pH initial = 5,4) par l’ajout d’acide (HCl) ou de base forte (NaOH).
Figure 23 : Production de la gallocine par le mutant Dgallo_rs10370
Test par diffusion sur gélose de l’activité gallocine présente dans le surnageant de Sgg WT et Dgallo_rs10370
produit en aérobiose ou en anaérobiose totale (ÆO2) déposé sur un tapis de Sgm incubé en aérobiose ou en
D- Rôle de Gallo_RS10370 dans la formation des ponts disulfures
Le gène gallo_rs10370 code pour une protéine potentiellement impliquée dans la
biosynthèse de la gallocine puisqu’il est induit par le système de régulation GSP-BlpRH.
Nous avons donc réalisé une délétion en phase de ce gène dans la souche Sgg UCN34 et
avons testé le surnageant du mutant pour sa capacité à produire la gallocine (Figure 23). Bien qu’une légère diminution de l’activité gallocine ait été observée plusieurs fois dans le
surnageant du mutant Dgallo_rs10370, ces résultats n’étaient pas toujours reproductibles
(Figure 23). Une analyse avec le logiciel SMART suggère que Gallo_RS10370 contient un peptide signal et un domaine fonctionnel de type « thioredoxin-like ». Les protéines contenant un domaine thiorédoxine chez les procaryotes permettent la réduction ou la formation de ponts disulfures entre deux cystéines et contiennent dans leur site catalytique un motif CxxC (Atkinson and Babbitt, 2009; Fabianek et al., 2000) qui est conservé dans la protéine Gallo_RS10370. Par ailleurs, il a été montré que la formation de ponts disulfures peut survenir spontanément en présence d’oxygène (Meehan et al., 2017). Ces mêmes expériences ont donc été reproduites en condition d’anaérobiose, une condition sans doute retrouvée dans
l’environnement du côlon. Les surnageants de Sgg WT et Dgallo_rs10370 ont été produits en
anaérobiose totale et testés contre un tapis de Sgm incubé 12h en aérobiose ou en anaérobiose
totale. Le surnageant de Dgallo_rs10370 semble moins actif lorsqu’il est produit en anaérobiose
et encore moins actif lorsque la boite sur laquelle le surnageant est déposé est elle aussi incubée en anaérobiose. Ces résultats suggèrent que la protéine Gallo_RS10370 est importante pour l’activité gallocine en condition anaérobies, probablement en favorisant la formation des ponts disulfures des peptides de la gallocine lorsqu’ils ne se forment pas spontanément. Cependant ces résultats n’ont cependant pas toujours été facile à reproduire et des expériences supplémentaires seront nécessaires pour confirmer le rôle de Gallo_RS10370.
Figure 24 : Le peptide Gip confère l’immunité à la gallocine
A et B : Courbes de croissance de souches contenant le plasmide pTCVWPtet-gip (+gip), ou en contrôle le
plasmide vide pTCVWPtet (-gip) en milieu THY contenant 33% de surnageant filtré de Sgg WT (+ gallocine) ou
Dblp (- gallocine) et du Tween20 à 0.1%. A : Croissance de SggDblp. B : Croissance de S. agalactiae A909. C :
Séquence primaire du peptide Gip. Les régions transmembranaires putatives prédites par SMART sont indiquées en bleu.