A transversality result

No presente estudo, descrevemos que a exposição crônica ao mercúrio em uma dose considerada tóxica é capaz de prejudicar a vasodilatação mediada pelo endotélio em anéis da aorta de ratos. Esta alteração vascular parece envolver a ativação do sistema renina-angiotensina local, a via do ácido araquidônico- ciclooxigenase e aumento do estresse oxidativo vascular. A consequente redução na biodisponibilidade NO resultou não apenas em uma reduzida participação dos canais para potássio ativados por cálcio (BKCa, SKCa), mas também na redução da

participação da Na+K+-ATPase. No entanto, quando avaliamos o papel da Na+K+- ATPase no relaxamento utilizando um doador de NO, foi possível observar um aumento da participação da NKA. De fato, a análise da expressão proteica evidenciou um aumento no conteúdo da subunidade α1 da Na+K+-ATPase.

Tomado em conjunto, isso pode sugerir um mecanismo compensatório do MLV devido a redução na biodisponibilidade de NO.

A diminuição da produção e da biodisponibilidade de substâncias vasodilatadoras, especialmente o NO, é realmente um fator que causa disfunção endotelial e está presente em várias condições patológicas (Maturana et al., 2007). O prejuízo nas ações do NO talvez seja considerado o evento mais importante no desenvolvimento de doenças cardiovasculares decorrentes da exposição ao mercúrio (Omanwar et al., 2011; Omanwar et al., 2014). A este respeito, os nossos resultados reforçam sugestões anteriores de que a disfunção endotelial está presente nessa condição, o que poderia contribuir para o aumento do risco de hipertensão, infarto do miocárdio, aterosclerose e doença coronária em

pessoas expostas ao mercúrio (Salonen et al., 1995; Houston et al., 2007; Houston et al., 2011). Estudos em animais com exposição ao HgCl2 relatam,

também, disfunção endotelial caracterizada por aumento da vasoconstrição mediada pela fenilefrina (Wiggers et al., 2008a; Peçanha et al., 2010; Lemos et al., 2012). Nesse contexto, o presente trabalho buscou investigar o impacto de uma dose mais elevada no relaxamento dependente e independente do endotélio e os possíveis mecanismos envolvidos, investigando a disfunção endotelial sob a óptica da vasodilatação prejudicada e não da modulação sobre a vasoconstrição, como anteriormente descrito.

Corroborando alguns poucos estudos que testaram o papel vasorelaxante do endotélio (Wiggers et al., 2008a; Peçanha et al., 2010; Furieri et al., 2011b), verificamos que a exposição ao HgCl2 promoveu uma redução da resposta

vasodilatadora dependente do endotélio em segmentos de aorta. Sabendo que essa resposta envolve principalmente o óxido nítrico, decidimos investigar o papel do NO no relaxamento mediado pela ACh, assim como os possíveis fatores que podem interferir com a sua produção e/ou ação. Quando avaliamos a ação do L- NAME, é possível notar bloqueio do relaxamento em ambos os grupos, mas com um efeito maior no grupo HgCl2. Tal fato, fora também sugerido pelo menor efeito

do L-NAME em aumentar a vasoconstrição mediada por fenilefrina, tanto em vasos de resistência quanto de condutância de animais expostos ao mercúrio (Wiggers et al., 2008b; Peçanha et al., 2010). O NO reduzido pode ser um resultado da produção prejudicada e/ou aumento de sua degradação. A este respeito, foi demonstrado que o metilmercúrio inibe a produção de NO e atividade da NOS em cultura de células endoteliais umbilicais humanas cultivadas

(Kishimoto et al., 1995). No entanto, Wiggers et al (2008a) mostrou aumento da expressão eNOS em artérias de resistência de ratos expostos com doses mais baixas de mercúrio, enquanto o trabalho de Peçanha (2009) também com baixas doses, não encontrou alteração na expressão da eNOS em aorta de ratos submetidos as mesmas doses baixas. Furieri et al (2011b) também mostrou redução da produção de NO sem encontrar alteração na expressão da eNOS em artéria coronária de ratos após exposição ao mercúrio. Ao mensurar a detecção ―in

situ” desse vasodilatador derivado do endotélio, mostramos uma menor

quantidade no grupo HgCl2 quando comparados com o CT, o que reforça os

nossos dados funcionais de menor biodisponibilidade de NO, embora não possamos afirmar ser um resultado de menor produção ou maior degradação.

Como a diminuição da biodisponibilidade de NO em condições patológicas podem também resultar da sua degradação metabólica por EROs (Sharma, et al., 2009), investigamos se o aumento do estresse oxidativo está relacionado com o prejuízo que encontramos na vasodilatação dependente do endotélio. Os nossos resultados indicam que a incubação com o Tiron, um ―varredor‖ de O2•-

,

relaxamento à ACh dos segmentos arteriais do grupo HgCl2 sem alterar esta

resposta no grupo CT. De fato, o estresse oxidativo parece mesmo estar presente na intoxicação por mercúrio. Foi demonstrado que a incubação com superóxido dismutase ou tiron, bem como o tratamento agudo ou crônico com apocinina, um inibidor de uma importante fonte vascular de ânion superóxido, a NADPH-oxidase, são capazes de impedir o aumento da resposta vasoconstritora em diferentes artérias de ratos expostos ao HgCl2 (Wiggers et al., 2008a; Furieri et al., 2011b;

Rizzetti et al., 2013; Azevedo et al., 2016). Além disso, a exposição ocupacional de trabalhadores de mineração por mercúrio elementar aumenta a formação de radicais livres em análises no sangue mesmo após vários anos que a exposição foi cessada (Kobal et al., 2004). Finalmente, foi demonstrado que o mercúrio também leva à diminuição de defesas antioxidantes (Brandão et al., 2008), como exemplo, glutationa peroxidase (Raymond & Ralston, 2004), superóxido dismutase e catalase (Rungby & Ernst, 1992).

De acordo com os dados apresentados, o mercúrio não só reduziu a ação do NO endotelial, mas também aumentou a geração de produtos vasoconstritores, tais como a angiotensina II e prostanóides locais derivados da COX que parecem contribuir para a vasodilatação prejudicada no nosso modelo de intoxicação crônica ao mercúrio.

Isso pode ser sugerido porque a incubação ―in vitro” com enalapril foi capaz de restaurar a vasodilatação dos segmentos de aorta do grupo de mercúrio. Estes dados reforçam estudos anteriores que mostram que a incubação com os inibidores da ECA ou antagonistas de receptores AT1 reduzem também a

hiperatividade vasoconstritora de ratos expostos ao mercúrio (Wiggers et al., 2008b; Peçanha et al., 2010; Azevedo et al., 2016). É bem sabido que a angiotensina II local desempenha um importante papel no tônus do músculo liso vascular, não só pela via vasoconstritora direta, mas também por meio da produção de EROs devido ao aumento da atividade e/ou expressão de NADPH- oxidase (Nguyen Dinh et al., 2013). Nesse sentido, foi demonstrado que em células do músculo liso vascular o mercúrio interfere nas vias de sinalização da

MAPK, resultando não só na ativação da NADPH-oxidase, mas também da COX- 2.

Quanto aos fatores derivados da COX, em nossos experimentos a indometacina não foi capaz de modificar a vasodilatação no grupo CT, enquanto na aorta do grupo mercúrio melhorou o relaxamento, indicando que o mercúrio pode estimular a liberação de prostanóides vasoconstritores. Em acordo, foi anteriormente demonstrado que mesmo doses menores de mercúrio já conduziam a um aumento da expressão da COX e de sua participação nas respostas vasoconstritoras de aorta de ratos (da Cunha et al., 2000; Peçanha et al., 2010). Além disso, foi recentemente demonstrada uma relação relevante entre COX e o estresse oxidativo em relação à disfunção vascular: enquanto as EROs são capazes de aumentar a expressão de COX-2, os produtos derivados da COX-2 podem ativar a NADPH-oxidase, aumentando a produção de EROs (Korbecki et al., 2013; Martínez-Revelles et al., 2012; Hernanz et al., 2014). Com isso, poderíamos sugerir que a ativação do sistema renina-angiotensina local pelo mercúrio poderia aumentar a formação de EROs e prostanóides, e diminuir a biodisponibilidade do NO, o que consequentemente, prejudicaria a vasodilatação mediada por ACh.

Entretanto, embora seja bem sabido que entre os fatores vasodilatadores derivados do endotélio o NO desempenhe papel relevante, a importância de cada fator bem como sua interação podem variar de acordo com o vaso e o contexto fisiopatológico. Os canais para potássio, por exemplo, participam na regulação do tônus do músculo liso vascular e do fluxo sanguíneo, e várias substâncias derivadas do endotélio podem modular a atividade desses canais (Haddy et al.,

2006). Nesse sentido, a exposição ao mercúrio pode causar um desequilíbrio entre a produção de NO e o estresse oxidativo causando disfunção endotelial, que pode ser compensado por relaxamento mediado por EDHF, principalmente representado pela ativação de canais para potássio em vasos de condutância como a aorta (Omanwar et al.,2015). Ao estudarmos a participação dos KCa,

utilizando a incubação com TEA, percebemos que essa inibição reduziu o relaxamento mediado por acetilcolina no grupo CT, sem alterar no grupo HgCl2, o

que sugere uma menor participação dos KCa nessa resposta endotélio-mediada.

Sabe-se que muitos subtipos de canais para K+ já foram identificados em células endoteliais e músculo liso, e que o seu envolvimento com doenças cardiovasculares depende do tecido vascular ou espécies estudadas (Félétou & Vanhoutte, 2009; Ko et al., 2008). Nos segmentos de aorta de ratos controle, houve redução na resposta após incubação com apamina, que inibe os SKCa e

com iberiotoxina, que inibem os BKCa, mas não houve nenhum efeito no grupo de

mercúrio. Em conjunto, estes dados indicam que os subtipos de canais cuja participação na vasodilatação endotélio-dependente foi reduzida após a exposição ao mercúrio foram os BKCa e SKCa. Em contrapartida, houve uma redução

semelhante na resposta vasodilatadora em ambos os grupos após a incubação com 4-aminopiridina, fármaco que inibe os Kv, indicando que o seu papel

aparentemente está inalterado. Wiggers et al (2008b), utilizou doses mais baixas do que em nosso estudo e também mostrou uma redução da participação dos canais para potássio no aumento da resposta vasoconstritora em artéria mesentérica de resistência, embora não tenha estudado o subtipo envolvido naquele contexto. Embora a incubação aguda com diferentes concentrações de

mercúrio pode estimular ou suprimir as correntes de efluxo de potássio sensíveis ao TEA ou glibenclamida em linfócitos B humanos (Gallagher et al., 1995) e células tubulares proximais do rim de rã (Nesovic-Ostojic et al., 2008), uma relação direta entre o mercúrio e a cinética desses canais na vasculatura ainda não fora adequadamente investigada, o que indica que nosso estudo seria pioneiro nesse assunto.

Todavia, como os fatores endoteliais tais com NO podem ativar diretamente canais para potássio, especialmente os BKCa (Bolotina et al., 1994), e ainda as

EROs podem modular negativamente a atividade destes canais (Tang et al., 2004), havia a possibilidade da menor participação desses canais ser consequência indireta de tais fatores e não um efeito direto do mercúrio. Dessa forma, procuramos avaliar se a redução da função dos KCa no grupo de HgCl2 foi

dada pela redução da biodisponibilidade do NO resultante do estresse oxidativo elevado. Para tanto, foi realizada uma avaliação da vasodilatação a uma fonte exógena de NO, utilizando a incubação com TEA e a co-incubação TEA + Tiron. Nos segmentos de aorta de animais CT a incubação com TEA promoveu a redução significativa na vasodilatação mediada por nitroprussiato de sódio, diferente do grupo mercúrio, que não alterou sua resposta. Mas ao avaliar uma co- incubação TEA + Tiron no grupo mercúrio, com uma quantidade conhecida de NO (doador de NO) e sem a influência de EROs devido a presença do Tiron, percebemos uma redução do relaxamento promovido pelo TEA, sugerindo uma possível integridade funcional dos KCa. Ademais, poderíamos especular também

que a redução da função desses canais para potássio na vasodilatação endotélio- mediada se deva a uma redução da biodisponibilidade de NO. Ou seja, embora a

função dos KCa esteja mantida, estes estão sendo menos ativados simplesmente

porque o NO está reduzido.

Além da hiperpolarização do músculo liso vascular por meio da ativação dos canais para potássio, também a Na+K+-ATPase, por ser responsável pela manutenção do potencial de membrana celular, pode contribuir para a regulação do tônus vascular em condições fisiológicas e fisiopatológicas (Marin e Redondo, 1999). Nesse ínterim, para o nosso melhor conhecimento, este é o primeiro estudo que testa os efeitos do mercúrio sobre a o papel funcional da Na+K+-ATPase no controle do tônus vascular. Nossos ensaios com ouabaína sobre a vasodilatação mediada pela acetilcolina indicam que a porção da NKA sensível à ouabaína tem papel reduzido em anéis de aorta de ratos expostos ao mercúrio. Ao utilizar os compostos orgânicos e inorgânicos de mercúrio foi demonstrada inibição da Na+K+-ATPase em várias espécies animais e tipos de células tais como tecido renal de rato (Kramer et al., 1986), guelras de peixes (Poopal et al., 2013), cérebro de rato (Chanez et al., 1989; Huang et al.,2008) e miocárdio de rato (Halbach et al., 1989; Furieri et al., 2011a). Na verdade, Nechay & Saunders já haviam proposto, em 1978, que o mercúrio seria capaz de inibir a Na+K+-ATPase em homogeinizado de rim humano, e em 1983, Yoshida havia relatado que eritrócitos provenientes de trabalhadores expostos com concentrações sanguíneas de mercúrio entre 29 e 111 ng/ml tiveram de fato uma redução da atividade bioquímica desta enzima. E Kade (2012) relata como pode ser fundamental verificar a interação do mercúrio com a Na+K+-ATPase na avaliação médica e na intervenção da toxicidade do mercúrio no sistema nervoso central, visto que a Na+K+-ATPase de eritrócitos possa ser marcador da toxicidade do mercúrio.

A NKA é uma enzima sulfidrila que contém tiol no sitio de ligação do K+, Na+ e ATP (Omotayo et al.,2011). E o mecanismo consensual é que Hg2+ reage com grupos sulfidrila presentes na Na+K+-ATPase (Kade, 2012). No entanto, uma vez que o NO é capaz de estimular também a Na+K+-ATPase (Gupta et al., 1994), nós decidimos analisar se a redução da biodisponibilidade de NO estaria mediando essa menor função da NKA no relaxamento induzido pela acetilcolina. De maneira interessante, quando o relaxamento foi estimulado por um doador de NO, a incubação com ouabaína, ao contrário do que esperávamos, indicou uma maior participação da NKA no grupo HgCl2. Reforçando nossos dados funcionais,

a análise por western blotting indicou maiores níveis proteicos da subunidade α1

da NKA no grupo Hg em relação ao grupo CT. Em conjunto, estes dados permitem sugerir que apesar do papel reduzido da NKA no relaxamento com acetilcolina, provavelmente devido à diminuída biodisponibilidade do NO após exposição ao mercúrio, a sua expressão se encontra aumentada provavelmente como um mecanismo de compensação.