Chapitre IV Résultats & discussion : Transporteurs mitochondriau
IV. A.7.1 Test fonctionnel spectrophotométrique
La réalisation de ce test implique premièrement l’incorporation de la protéine en liposomes à un ratio lipide/protéine de 300 (w/w). Des essais d’incorporation à ce ratio ont été réalisés pour rUCP1 purifié en présence de DDM ou de F8TAC5. Les mêmes conditions
d’incorporation et de mesure d’activité que celles utilisées pour la protéine native UCP1 ont été employées. Le seul paramètre qui a été modifié a été la quantité de détergent présente au moment de l’incorporation. Il s’agit d’un paramètre important pour la réussite de l’incorporation car le pourcentage d’insertion de la protéine dans les liposomes peut varier en fonction du degré de solubilisation des liposomes par le détergent (Rigaud 1995).
La protéine native est généralement purifiée en présence de Triton X-100. La concentration finale de détergent estimée dans la fraction d’élution d’UCP1 native est d’environ 2% (w/v). Lors de l’incorporation en liposomes, cette fraction d’élution est mélangée avec des liposomes, la concentration résultante de Triton X-100 étant de 0,16% (w/v). Cette quantité de détergent est suffisante pour déstabiliser les liposomes et permettre l’incorporation de la protéine dans les liposomes.
La protéine recombinante est purifiée dans des surfactants différents (F8TAC5 ou
DDM). Lors des premiers essais, le mélange de la protéine avec les liposomes sans ajout supplémentaire de détergent n’a pas conduit à des liposomes fonctionnels. Une des hypothèses expliquant ce résultat peut être le fait que la quantité de DDM ou de F8TAC5
présente ne permet pas à la protéine de s’insérer correctement dans les liposomes. Le DDM est connu pour être un détergent qui solubilise lentement les liposomes et le F8TAC5 est un
surfactant qui ne se mélange pas avec les lipides et donc qui ne peut pas déstabiliser les liposomes.
Une solution possible afin de déstabiliser les liposomes et permettre l’incorporation est l’ajout du Triton X-100 lors de la reconstitution. Une courbe de la solubilisation des liposomes en fonction de la concentration en triton a alors été établie (Figure 35). En fonction de cette courbe, des quantités de Triton X-100 allant de 0,16% à 1% (w/v) et correspondant à différents points de la courbe ont été ajoutées au moment de l’incorporation. Cependant, aucune de ces conditions n’a conduit à des protéoliposomes fonctionnels. Une activité a pu être mesurée seulement une fois, lors de l’incorporation de la protéine recombinante purifiée en DDM et l’ajout de 0,6% (w/v)Triton X-100 mais ceci n’a pas été reproductible.
Figure 35. Courbe de solubilisation des liposomes par le Triton X-100
Des quantités croissantes de Triton X-100 ont été ajoutées aux liposomes contrôle (sans protéine) et l’absorbance est lue à 600 nm. Pour des concentrations faibles de Triton X-100 l’absorbance augmente, dû à une saturation des liposomes par des molécules de détergent. Au-delà de 0,3%, les molécules de détergent commencent à solubiliser les liposomes et une décroissance de l’absorbance peut être remarquée. A environ 1% , l’absorbance est proche de zéro indiquant que les liposomes ont été complètement solubilisés
Afin de déterminer si le manque de fonctionnalité est dû à un défaut d’incorporation de la protéine en liposomes, la technique de flottaison des liposomes dans des gradients de saccharose a été utilisée. Cette technique permet la séparation des protéines en fonction de leur incorporation en liposomes. Si la protéine n’est pas incorporée, elle va se retrouver en bas du gradient de saccharose alors que, si elle est incorporée, elle va se retrouver dans la fraction de liposomes au pourcentage de saccharose correspondant à la densité des liposomes.
La Figure 36 présente les résultats obtenus pour les liposomes incorporant la protéine native (P-Native) et pour les protéoliposomes avec la protéine recombinante purifiée en présence de F8TAC5 (P-FTAC) ou DDM (P-DDM).
Figure 36. Vérification de l’incorporation en liposomes d’UCP1
Les fractions en gras marquées avec une étoile sont les fractions contenant les liposomes. P-Native – protéoliposomes avec UCP1 native ; P-FTAC- protéoliposomes avec rUCP1 recombinant purifié en FTAC ; P-DDM- protéoliposomes avec rUCP1 recombinant purifié en DDM. 0,8% de Triton X-100 a été ajouté lors de l’incorporation en liposomes. Western blot avec anticorps contre rUCP1 pour la protéine native et contre l’étiquette histidine pour la protéine recombinante. Les deux bandes principales observées sur le gel pourrait correspondre à la protéine monomérique et dimérique respectivement.
Pour P-Native, la protéine est détectée dans la fraction contenant les liposomes. Ce n’est pas le cas pour P-FTAC et P-DDM, la protéine se retrouvant dans presque toutes les fractions du gradient. Pour P-FTAC, il est possible que la protéine recombinante soit encore entourée par le FTAC ce qui lui permet de flotter dans le gradient. En effet, FTAC n’est pas adsorbé par les biobeads et il peut donc rester autour de la protéine. Pour P-DDM une explication similaire peut être proposée. La synthèse in vitro se réalise en présence de FTAC
et même si le FTAC est échangé par le DDM au cours de la purification, il se peut que cet échange ne soit pas complet et que des molécules de FTAC restent attachées à la protéine. Une étude intéressante (Park 2007) montre qu’une autre protéine membranaire, MscL, purifiée en présence de FTAC, peut s’incorporer spontanément en liposomes. Les auteurs postulent que, en présence de liposomes, la protéine va préférer les lipides par rapport au FTAC ce qui va favoriser son incorporation en liposomes. Vu les résultats obtenus, ceci ne semble pas être le cas pour la protéine UCP1 recombinante.
L’état de la protéine est un autre paramètre qui peut influencer son incorporation en liposomes. Généralement, pour les expériences présentées ci-dessus, l’incorporation en liposomes se fait un jour après sa purification, la protéine étant gardée à 4°C entre temps. Il est possible que pendant ce temps, la protéine soit abîmée sans toutefois précipiter. Pour tester cette hypothèse, des études de reconstitution ont été réalisées en utilisant la protéine juste à la sortie des étapes de purification. La vérification de l’incorporation à l’aide des gradients de saccharose, montre que la protéine a été incorporée dans les liposomes (Figure 37) . Il reste à vérifier la fonctionnalité de ces liposomes.
Figure 37. Vérification de l’incorporation en liposomes d’UCP1
Les fractions en gras marqués avec une étoile sont les fractions contenant les liposomes. Le gel est restreint à la seule portion indiquant un signal