Com relação à percentagem de oxidação e formação de calo não houve diferença significativa entre os três tratamentos (Tabela 3 e Anexos 39 a 42). Os números médios de gemas por explante foram 3,90; 2,53 e 1,62 para três concentrações de Km testadas (12,5; 25 e 50 mg L-1, respectivamente) após 60 dias de período de co-cultura, demonstrando que a concentração de Km pode ter influenciado a organogênese do tecido, mais especificamente durante a diferenciação dos calos em gemas.
Mesmo não sendo verificada diferença estatística entre os tratamento aos 60 dias da transformação, constatou-se que após 120 dias, o tratamento com a menor concentração de Km (12,5 mg L-1)permitiu a sobrevivência do maior número de explantes. A manutenção dos explantes durante 120 dias nas três concentrações testadas de Km revelou que uma grande quantidade de regenerantes era constituída por escapes, que não possuíam o gene de resistência a canamicina e que necrosaram ao término desse período.
A definição da concentração ideal para a seleção de células transformadas é uma etapa de grande impacto no sucesso de todo um sistema de transformação genética e, para o gênero Eucalyptus, mostra-se bastante variável em função dos autores. Mullins et al. (1997) relataram que 9 mg L-1 de Km foi suficiente para selecionar plantas de E. camaldulensis transgênicas. Já
para E. tereticornis, Prakash e Gurumurthi (2009) estabeleceram um protocolo eficiente, cuja frequência de transformação variou de 14,4 a 21,2%, e cuja concentração de canamicina para selecionar as plantas transformadas, foi 40 mg L-1, sendo que concentrações superiores a esta inibiram totalmente a regeneração.
Tabela 3 - Efeito de três concentrações de Km sobre a organogênese de explantes cotiledonares de Eucalyptus saligna após co-cultura com Agrobacterium tumefaciens. Média de dois experimentos.
Após 60 dias da
Transformação Após 120 dias da Transformação Km (mg L-1) gus (%)* Explantes Oxidados (%)** Explantes com Calo (%)** Explantes com Gema (%)** Número médio gemas/ explante*** Explantes com gemas (%)** Explantes necrosados (%)** 12,5 40 31,99 a 67,7 a 24,0 a 3,90 a 12 88 25 47 37,29 a 59,9 a 16,0 b 2,53 b 1 99 50 33 37,96 a 63,9 a 14,6 b 1,62 c 0 100 CV (%) 26,3 20,1 8,2 17,06
Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem estatisticamente pelo Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade de erro. Análises de variância (Anexos 39 a 42). * Análise aos 5 dias da inoculação. ** Em relação ao número de explantes totais/iniciais. *** Número médio de gemas por explante com gemas.
Wu et al. (2011) observaram a influência da Km na organogênese indireta em diferentes explantes de maçã. Em meio sem Km, 71,1% dos fragmentos foliares formaram calos e 47,7% desenvolveram brotos, já em meio com 20 mg L-1 de Km, a formação de calos reduziu para 23,2%. Nesse sentido, QUISEN et al. (2009) mostraram que a Km é adequada para a seleção de células transformadas de E. camaldulensis na concentração de 9 mg L-1 e observaram também que as doses mais altas do antibiótico foram fitotóxicas, não permitindo a seleção das plantas transformadas. Seus resultados demonstram que a capacidade calogênica e organogênica dos explantes cotiledonares de E. camaldulensis foi fortemente influenciada pelo agente seletivo utilizado, pois a partir de 3,0 mg L-1 de Km, mesmo com 1,5 brotações/calo ocorreu uma redução de 50% nas médias obtidas para formação de calos organogênicos e brotações regeneradas em comparação com o tratamento controle. Esta elevada toxicidade da Km em tecidos de eucalipto tem sido observada por diversos autores, como Gonzáles (2002) em E. grandis.
Para esse mesmo autor, a existência de variabilidade genética em Eucalyptus para tolerância/resistência a alguns antibióticos permite a ocorrência de escapes, bem como diferentes respostas aos antibióticos incorporados no meio de cultura que podem interferir
com a organogênese in vitro das espécies. Nesse sentido, Dominguez et al. (2004) comentam que, embora seja necessária uma alta pressão de seleção do antibiótico para o sucesso da transformação de Citrus via Agrobacterium, ela inibe a regeneração de brotos na maioria das células transformadas e não transformadas.
De outro lado, quando se diminui a pressão de seleção, promove-se a regeneração de escapes e brotações quiméricas, tornando-se ineficientes os protocolos de transformação (MATTHEWS et al., 1998; DOMINGUEZ et al., 2004; FLACHOWSKY et al., 2008).
Mediante a análise molecular, constatou-se que, mesmo após um longo período em meio com agente seletivo, houve regeneração de escapes no presente experimento. O PCR dos 13 eventos sobreviventes, 12 regenerados em meio contendo 12,5 mg L-1 de Km e um regenerado em meio com 25 mg L-1, indicou a presença do gene gus em três eventos do tratamento com 12,5 mg L-1 de Km (Figura 3). A eficiência de transformação no presente experimento foi de 1,5% (3/200), três vezes superior a encontrada por Dibax et al. (2010). Contudo, após os 120 dias de cultura in vitro não foi verificada a presença do gene p5csf129a nas amostras (Figura 4).
Figura 3- Eletroforese dos produtos do PCR realizado com DNA de Eucalyptus saligna. A. Marcador de peso molecular (Ladder 100 pb). B. Eventos regenerados em 12,5 ou 25 mg L-1 de canamicina. C. Controle negativo. D. Controle positivo: DNA da bactéria contendo o gene gus. A flecha indica a banda do gene gus em três eventos regenerados e mantidos em 12,5 mg L-1 de Km.
Figura 4- Eletroforese dos produtos do PCR realizado com DNA de Eucalyptus saligna. A. marcador de peso molecular (Ladder 100 pb). B. Eventos de plantas de E. saligna regenerados em 12,5 ou 25 mg L-1 de canamicina. C. Controle positivo: DNA plasmidial contendo o gene p5csf129a. D. Controle negativo.
A ocorrência de algum problema durante a extração do DNA pode ter contribuído para esse resultado negativo, como por exemplo, a presença de compostos fenólicos, já que estes contaminantes, liberados durante a lise celular, aderem irreversivelmente ao DNA, inibindo a digestão com endonucleases de restrição e/ou a amplificação através de PCR (COUCH e FRITZ, 1990). Outra possibilidade seria em relação às condições do PCR, que podem ter sido desfavoráveis à detecção do gene. Além disso, pode ter ocorrido, durante a transferência do T- DNA para a célula vegetal, somente a inserção da porção que continha o gene repórter e o marcador de seleção. Alguns autores mencionam a influência do tamanho do T-DNA na eficiência da transformação via Agrobacterium tumefaciens. O T-DNA contido no plasmídeo utilizado nesse experimento apresenta 8,5 kb (CHEN et al., 2003). Park et al. (2000) demonstraram que pequenos fragmentos de T-DNA aumentam a eficiência da transformação em comparação com fragmentos grandes, em tabaco, algodão e arroz. Ao utilizarem T-DNA com 8,4 kb, os autores obtiveram 12%, 5,3% e 10,7% de eficiência em explantes de tabaco, algodão e arroz, respectivamente. Com a utilização de T-DNA contendo 4,3 kb, estes valores aumentaram para 19%, 10,1% e 23,8%.
Em 96 plantas transgênicas de petúnia resistentes a canamicina, Deroles e Gardner (1988) constataram que pelo menos 24 delas haviam perdido uma ou ambas as extremidades do T-DNA. Eles observaram que um pouco mais da metade das plantas transformadas continham o T-DNA intacto. No presente experimento, a construção gênica utilizada continha o gene de interesse na extremidade esquerda do T-DNA (Figura 1) e pode ter perdido esse fragmento durante a transferência.