5.2 Screening biologique
5.2.2 Évaluation de l’activité anti-inflammatoire
5.2.2.1 Inhibition de la dénaturation de l’albumine
L’effet protecteur de l’extrait n-BuOH de L. tingitana contre la dénaturation de l’albumine membranaire induite par la chaleur a été évalué in vitro selon la méthode décrite par Sakat et collaborateurs [13]. La mesure de la turbidité a été faite à λ=660 nm par spectrophotométrie et les résultats ont été comparés aux ceux du diclofénac, l’anti-inflammatoire non stéroïdien comme référence. Le pourcentage d’inhibition de la dénaturation de l’albumine est calculé selon la formule suivante:
(%) Inhibition de la dénaturation = 100 −A1
A0 ×100
A0: est l’absorbance de l’échantillon/standard. A1: est l’absorbance de la solution de contrôle.
5.2.2.2 Stabilisation des membranes des globules rouges (HRBC)
Cette technique consiste à un dosage in vitro pour évaluer l’effet protecteur de l’extrait n-BuOH de L. tingitana contre la lyse membranaire des globules rouges (HRBC) induite par l’hypotonicité [14]. La teneur en hémoglobine dans la suspension a été estimée par spectropho-tométrie à λ=560 nm. Le pourcentage de l’hémolyse produite en présence de l’eau distillée a été pris à 100%. La stabilisation ou la protection de la membrane des HRBC a été calculée par la formule suivante:
(%) Stabilisation = 100 −A1
A0: est l’absorbance de l’échantillon/standard (diclofénac). A1: est l’absorbance de la solution de contrôle.
5.2.2.3 Induction de l’œdème dans la patte par la carragénine
L’expérience a été effectuée selon le protocole de Srivastava et ses collaborateurs [15]. L’étude a été réalisée sur des rats Albinos wistar provenant de l’élevage au niveau de l’animalerie de l’Université des Frères Mentouri Constantine. Les rats (200-220 g) sont regroupés par lot de cinq. Ils ont été mis à jeun 12 heures avant l’administration des produits et répartis en quatre groupes:
— Groupe 1: les rats témoins qui reçoivent par gavage l’eau physiologique.
— Groupe 2: les rats reçoivent oralement Diclofénac-sodique à une dose de (10 mg/kg) [15]. — Groupe 3: les rats reçoivent l’extrait n-BuOH de L. tigitana par gavage à une dose de
(100 mg/kg).
— Groupe 4: les rats reçoivent l’extrait n-BuOH de L. tigitana par gavage à une dose de (200 mg/kg).
Une heure plus tard, l’inflammation chimique a été provoquée par l’injection de 0,1 ml de car-ragénine à (1%) dans une solution saline isotonique sous l’aponévrose plantaire de la patte postérieure gauche des rats.
Détermination du volume de l’œdème de la patte
La progression du volume de l’œdème des pattes gauche de chaque rat a été mesuré une heure avant l’induction de l’œdème et (à 1, 2, 3, 4, et 24h) après l’injection de la carragénine en utilisant le vernier caliper numérique. L’œdème a été traduit par une augmentation en épaisseur des pattes (mm) due à la provocation inflammatoire. Pour chaque groupe traité, les diamètres moyens obtenus à ces différents relevés, extrait ou diclofénac, (Dt) ont été comparés à celui obtenu avant tout traitement (D0), permettant ainsi de calculer les pourcentages d’œdème (pourcentage d’inflammation), à partir de la formule:
(%) inflammation = D0− At
Tandis que le pourcentage d’inhibition de l’œdème a été calculé selon la relation:
(%) inhibition = (Dt− D0)témoin−(Dt− D0)traité
(Dt− D0)témoin ×100
5.2.2.3.1 Mesure de l’activité de myéloperoxydase (MPO)
L’accumulation des neutrophiles dans la patte des rats a été mesurée par l’évaluation de l’activité de la myéloperoxydase (MPO). Après 24 heures d’induction de l’inflammation les rats ont été sacrifiés par dislocation cervicale et les tissus des pattes derrières (50-100 mg) ont été recueillis et homogénéisés. L’activité de la MPO dans les homogénats des pattes a été évaluée par la mesure du changement d’absorption à λ =450 nm en présence d’o-dianisidine dihydrochlurure et 0.006% de H2O2 selon le protocole de Posadas et ses collaborateurs [16]. L’activité MPO est calculée en utilisant le coefficient d’extinction molaire (1.13×104 cm−1M−1) de o-dianisidine oxydé. Les résultats sont exprimés en MPO U/mg de tissu dont l’unité (U) de l’activité MPO a été définie telle que la conversion de 1 µmol de H2O2 en eau dans 1 min à 25◦C [16].
5.2.2.3.2 Dosage de malondialdéhyde (MDA)
Le malondialdéhyde (MDA) est l’un des produits terminaux formés lors de la décomposition des acides gras polyinsaturés sous l’effet des radicaux libres libérés au cours du stress oxydant. La réaction de dosage repose sur la formation en milieu acide et chaud (100◦C) entre le MDA et deux molécules de thiobarbiturique acide (TBA) donnant un pigment de couleur rose ayant une absorbance maximale à λ=532 nm selon cette réaction:
Le taux de MDA a été mesuré dans les homogénats des pattes des rats selon la méth-ode décrite par Ohkawa et ses collaborateurs [17]. L’absorption a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre à λ=532 nm et les résultats sont exprimés en nmol par milligramme de tissu intra-plantaire (nmol/mg tissu) en utilisant le coefficient d’extinction molaire 1.56×105 cm−1M−1
[17].
5.2.2.3.3 Étude histologique
Les petits morceaux de la surface plantaire des pattes derrières ont été pris 24 heures suivant l’injection intra-plantaire de la carragénine et ils ont été mis dans le formaldéhyde 10% à pH 7,4 et stockés pour l’examen histologique. Les biopsies prises des pattes ont été inclus dans la paraffine, coupés (2 à 5 µm) puis subis une coloration avec l’hématoxyline- éosine.
5.2.2.4 Péritonite induite par la carragénine
La migration des neutrophiles vers la cavité péritonéale des rats a été mesurée selon la technique développée par Da Silva Guerra et ses collaborateurs [18]. Les rats Albinos wistar ont été répartis au hasard en quatre lots de cinq pour chacun qui reçoivent:
— Groupe 1: l’eau physiologique.
— Groupe 2: diclofénac à une dose de (10 mg/kg) [18].
— Groupe 3: l’extrait n-BuOH de L. tigitana par gavage à une dose de (100 mg/kg).
— Groupe 4: l’extrait n-BuOH de L. tigitana par gavage à une dose de (200 mg/kg).
Après 1 heure, une péritonite est induite chez les rats par une injection d’une solution de (1%) de carragénine par voie intra-péritonéale préparée dans une solution saline isotonique. Après 4 heures les rats ont été sacrifiés par dislocation cervicale et leurs cavités péritonéales ont été lavées avec 2 ml du PBS (pH=7,5), et le fluide péritonéal a été collecté dans des tubes contenant l’anticoagulant l’EDTA. Des aliquotes péritonéales ont été stockés à −80◦C pour la mesure des taux de (NO). La numération des leucocytes et des neutrophiles a été effectuées après coloration par la solution de Turk (0.2% colorant cristal violet dans 30% d’acide acétique). Les résultats sont exprimés en nombre de cellules par millimètre de solution péritonéal [19].
Le pourcentage d’inhibition des leucocytes a été calculé selon la formule suivante:
(%) inhibition =1 − T
C
×100
T: représente le nombre des leucocytes dans les groupes traités. C: représente le nombre des leucocytes dans le groupe témoin.
5.2.2.4.1 Détermination du taux du (NO)
Pour déterminer le taux de production du (NO) la mesure de concentration de nitrate dans l’exsudat a été mesurée selon le protocole de conversion du nitrate grâce à la réaction de Griess [20]. L’absorbance a été mesurée à λ=540 nm et la teneur en nitrite a été calculée grâce à la courbe standard du nitrite de sodium et comparée avec la courbe standard préparée avec le NaNO2. Les résultats sont exprimés en µM de (NO).