4.1.1.4.4.4 Extração de proteínas celulares
Proteínas celulares foram extraídas dos micélios crescidos em meio líquido com ou sem suplementação com ferro. Amostras (50 – 100 mg peso seco) foram
resuspensas em 3 mL de tampão Tris-HCl (pH 8,9) previamente resfriado. Estas suspensões foram mecanicamente rompidas em tubos de centrífuga de 15 mL com o auxílio de vortex usando 3 mL de esferas de vidro (0,5 mm de diâmetro) (proporção 1:1, v/v). As misturas foram rompidas cinco vezes por 1 min com intervalo de 30 s em banho de gelo. Os sobrenadantes foram coletados após centrifugação por 15 min a 6.000.g para remover os resíduos celulares. A fração insolúvel foi submetida a uma nova etapa de extração, desta vez conduzida por saponificação com NaOH (0,5 M) (BRAAKSMA; SCHAAP, 1996) antes de ser levada ao microondas por 20 s, a 40% de potência. Em seguida, a mistura foi neutralizada com HCl (0,5 M), e o sobrenadante recolhido por centrifugação por 15 min a 6.000.g. As frações celulares solúveis obtidas após as centrifugações foram unidas e utilizadas para determinação do teor de proteína total e submetidos à eletroforese.
4.1.1.4.4.5 Determinação de proteínas celulares totais
A determinação da concentração de proteínas totais presentes nos extratos celulares foi determinada utilizando o método de Bradford (BRADFORD, 1976), que consistiu em adicionar 100 μL de amostra a 1 mL do reagente de Bradford, agitar e ler a absorbância a 595 nm. A concentração de proteínas nas amostras foi determinada através de uma curva de calibração, preparada com albumina de soro bovina.
O reagente de Bradford foi preparado pela dissolução de 100 mg de Azul de Comassie G-250 em uma mistura de 100 mL de ácido fosfórico 85% e 50 mL de metanol 95%. Depois de completa dissolução do corante, adicionou-se água até completar o volume para 1 L (BRADFORD, 1976).
4.1.1.4.4.6 Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE)
As eletroforeses sob condições desnaturantes foram realizadas em gel de poliacrilamida de duas fases de diferentes porosidades e valores de pH e na presença de SDS (dodecil sulfato de sódio) (ALFENAS et al., 1991). O aparelho utilizado foi um Hoefer / Mini VE Vertical Electrophoresis System (Amersham Bioscience), com placas de vidro (10 x 10 cm) onde os géis foram montados. A cuba
para eletroforese foi preenchida com tampão Tris-glicina pH 8,9, diluído 1:10 em água desionizada com 1% SDS antes do início de cada corrida.
4.1.1.4.4.6.1 Preparo dos géis SDS-PAGE
Géis de poliacrilamida foram formados por copolimerização de acrilamida e Bis-acrilamida (Bis) na presença de persulfato de amônio e tetrametiletilenodiamina (TEMED). Os componentes acrílicos foram preparados segundo Laemmli (1970), em duas fases, chamada de sistema descontínuo, que consiste dos géis concentrador e separador.
Os géis concentradores e separadores foram preparados com os componentes descritos nas Tabela 2 e Tabela 3, respectivamente.
Tabela 2 – Gel concentrador
Soluções Concentração 4,5% Acrilamida: Bis-acrilamida (36,5:1) 2,25 mL Tris-HCl 0,6173 M pH 6,8 1,50 mL Água desionizada 11,15 mL SDS 10% (p/v) 0,075 mL Persulfato de amônio 10% (p/v) 0,05 mL TEMED 0,01 mL
Tabela 3 – Gel separador
Soluções Concentração 12,5% Acrilamida: Bis-acrilamida (36,5:1) 12,50 mL Tris-HCl 3,778 M pH 6,8 3,00 mL Água desionizada 14,21 mL SDS 10% (p/v) 0,15 mL Persulfato de amônio 10% (p/v) 0,10 mL TEMED 0,04 mL
4.1.1.4.4.6.2 Preparo das amostras e do tampão da amostra
As amostras para as corridas eletroforéticas foram preparadas colocando dentro de tubos “Eppendorf” 30 μg de proteínas celulares de W. cocos ou 50 μg de
proteína de P. medulla-panis e volume de tampão da amostra suficiente para que o
volume final fosse 40 μL. Os tubos foram fervidos por 5 min, e as proteínas
desnaturadas foram injetadas no gel de eletroforese. Após as corridas, as bandas de proteínas foram reveladas pela técnica de coloração com nitrato de prata (ALFENAS et al., 1991).
O tampão da amostra foi composto de 2 mL Tris-HCl 1 M (pH 6,8), 4 mL
SDS 10% (p/v), 2 mL β-mercaptoetanol, 5 mL glicerol, e 0,01 g de azul de
bromofenol.
4.1.1.4.4.6.3 Revelação com nitrato de prata e determinação das massas molares das proteínas celulares
Após a corrida eletroforética, as bandas protéicas presentes no gel foram reveladas por impregnação com nitrato de prata da seguinte forma: o gel foi incubado por 30 min em uma solução contendo 100 mL de etanol (99,8%), 25 mL de ácido acético glacial (99,7%) e água destilada em quantidade suficiente para completar 250 mL de solução. Em seguida o gel foi transferido e mantido por mais 30 min em uma solução contendo 75 mL de etanol (99,8%), 1,25 mL de glutaraldeído (25%), 10 mL de tiossulfato de sódio (5%), 17 g de acetato de sódio e água destilada em quantidade suficiente para completar 250 mL de solução. O gel foi então lavado com água destilada por 3 vezes e deixado por 15 min nesta solução. Após as lavagens o gel foi incubado em outra solução contendo 25 mL de nitrato de prata (2,5%), 0,1 mL de formaldeído (37%) e água destilada completando o volume da solução para 250 mL. Nesta solução, o gel permaneceu ao abrigo da luz por 20 min. Novamente, o gel foi lavado com água destilada e em seguida adicionado a uma solução contendo 6,25 g de carbonato de sódio anidro, 0,05 mL de formaldeído (37%) e água destilada em quantidade suficiente para 250 mL de solução, onde permaneceu até o aparecimento das bandas de proteínas impregnadas por nitrato de prata. A reação foi então interrompida por uma solução contendo 3,65 g de EDTA em 250 mL de água destilada. Todas as soluções foram preparadas no momento do uso.
As massas molares das proteínas presentes nos géis foram estimadas utilizando-se do gráfico dos logaritmos das massas molares (log MM) das proteínas padrões pelas suas respectivas mobilidades eletroforética (cm). Foram utilizados os
padrões descritos na Tabela 4. Os marcadores foram dissolvidos em 100 μL de tampão da amostra, fervidos por 5 min e armazenados no congelador. Para cada gel aplicou-se em uma canaleta um volume de 7,0 μL desta solução padrão.
Tabela 4 - Proteínas padrões
Proteínas Massa Molar (kDa)
Soroalbumina bovina 66
Ovoalbumina 45 Anidrase carbônica 29
α-Lactoalbumina 14,3
4.1.2 Estudo da influência de diferentes fontes de carbono na produção de