Pour tester l'efficacité des divers agents thérapeutiques sélectionnés, les cellules de témoins et patients ont été incubées simultanément avec la combinaison de palmitate 1 mM et de lactate 10 mM et avec l'agent thérapeutique ciblé, puis la mort cellulaire a été mesurée par nécrose et apoptose.
Tout d'abord, le MB a été testé pour ses nombreux effets bénéfiques au niveau de la fonction mitochondriale et pour son rôle d'accepteur d'électrons. Le MB, à 125 nM *, combiné au palmitate et au lactate, a permis une diminution de la nécrose de 3,3 % pour la moyenne de 2 lignées cellulaires de témoins (T1 et T2), de 8,0 % pour les cellules de l’hétérozygote composé et de 3,8 % pour la moyenne des 3 lignées cellulaires de patients (Figure 19A, p. 64). La diminution de l’apoptose
était plus importante, soit de 24,4 % pour les cellules du T2, de 34,5 % pour celles de l’HC et de 14,1 % pour celles du P2 (Figure 19B, p. 64).
Figure 19 : Effet du MB à 125 nM sur la mort cellulaire induite par une concentration élevée de palmitate et de lactate. (A) représente la nécrose, une expérience réalisée en
triplicata (moyenne ± SEM du triplicata) où le temps d’incubation est de 48 h. (B) représente l’apoptose, une expérience réalisée en triplicata (moyenne ± SEM du triplicata) où le temps d’incubation est de 24 h.
A
Le découpleur de la chaîne de transport des électrons, le DNP, à des concentrations de 10, 25 et 50 μM, a eu des effets mitigés lorsque testé sur au moins une lignée cellulaire de témoin et de patient. Il a généralement eu un effet bénéfique en apoptose (24 h d’incubation), mais un effet néfaste en nécrose (48 h d’incubation), et les résultats variaient d’une expérience à l’autre (données non présentées). Il s’est donc avéré difficile de tirer une conclusion quant à l'efficacité de cet agent. De plus, étant donné sa toxicité connue lorsqu’utilisé à forte dose, nous avons jugé inutile de poursuivre les expériences avec ce produit.
Nous avons aussi examiné l’effet de trois antioxydants, soit le resvératrol, le NAC et l’idebenone, un analogue du coenzyme Q. Contrairement à nos attentes, tous les antioxydants ont induit une augmentation de la nécrose. En effet, le resvératrol à 10, 50 et 100 µM (Figure 20, p. 66) et le NAC à 1 mM (données non présentées) ont accentué le pourcentage de nécrose résultant de la combinaison de palmitate et de lactate, et cela autant chez les cellules de témoins que de patients. L'idebenone, à 10 et 25 µM, a eu un effet opposé entre les mesures de nécrose et d'apoptose, soit une augmentation du taux de nécrose et une diminution de l'apoptose (Figures 21A et 21B, p. 66 et 67). Ceci pourrait s’expliquer par le fait que, lorsque le stress est trop grand, les cellules peuvent passer d’une mort par apoptose à une mort par nécrose.
Figure 20 : Effet du resvératrol sur le pourcentage de nécrose induit par une
concentration élevée de palmitate et lactate. Cellule : représente l’état basal qui contient le
véhicule. PL : représente la combinaison de palmitate 1mM et de lactate 10mM. Une expérience réalisée en triplicata (moyenne ± SEM du triplicata). Le temps d’incubation est de 48h.
Figure 21 : Effet de l’idebenone sur la mort cellulaire induite par une concentration élevée de palmitate et lactate. L’état basal contient le véhicule. PL : combinaison de
palmitate 1 mM et de lactate 10mM. (A) représente la nécrose, une expérience réalisée en triplicata (moyenne ± SEM du triplicata) où le temps d’incubation est de 30 h. (B) représente l’apoptose, une expérience réalisée en triplicata (moyenne ± SEM du triplicata) où le temps d’incubation est de 24 h.
Les deux inhibiteurs du PTP, soit la cyclosporine A (0,2 μM) et le sildénafil (10 μM), ainsi que l'agoniste de PPAR-α, le fénofibrate (20 μM), n'ont pas eu d’effet d’augmentation ou de diminution de la nécrose cellulaire induite par la combinaison de palmitate et de lactate (données non présentées). Le sildénafil est le seul agent à avoir aussi été testé sur l’apoptose, et encore une fois, aucun effet n’a été observé (données non présentées). Ces agents ont toujours été testés sur au moins une lignée cellulaire de témoin et de patient à des temps d’incubation de 24 h pour l’apoptose et de 48 h pour la nécrose.
Finalement, l’effet de la carnitine (1 mM) sur la nécrose et l’apoptose cellulaire induite par la combinaison de palmitate et de lactate a été mesuré sur les cellules des lignées T2 et P3. Suite à une incubation de 24 h (apoptose) ou de 34 h
(nécrose), les différences au niveau de la mortalité ont surtout été observées chez les cellules du patient. En effet, la carnitine a diminué la mort chez ces cellules de 38,3 % pour la nécrose et de 5,0 % pour l’apoptose (Figures 22A et 22B, p. 68 et 69). Le propionate (0,2 mM), lorsqu’ajouté à la carnitine, a eu un effet différent sur la nécrose et sur l’apoptose. En nécrose, la diminution de la mort cellulaire a été moins importante (20,2 %) que l’effet de la carnitine seule. Toutefois, en apoptose, la diminution de la mort cellulaire a été fortement accentuée (38,9 %) (Figures 22A et 22B, p. 68 et 69). Il est intéressant de constater que malgré un effet minime obtenu avec le MB et le sildénafil lorsqu'ils sont utilisés seuls, ces derniers ont contribué à la diminution de la mortalité lorsqu'ils ont été utilisés en combinaison avec la carnitine et le propionate. En effet, la combinaison de ces 4 agents a permis une diminution de 55,5 % en nécrose et de 53,6 % en apoptose (Figures 22A et 22B, p. 68 et 69).
Figure 22 : Effet de la carnitine 1 mM, du propionate 0,2 mM, du MB 125 nM et du sildénafil 10 μM sur la mort cellulaire induite par une concentration élevée de palmitate et lactate. La combinaison de palmitate 1mM et de lactate 10mM est présente dans chacun
des cas. (A) représente la nécrose, une expérience réalisée en triplicata (moyenne ± SEM du triplicata) où le temps d’incubation est de 34 h. (B) représente l’apoptose, une expérience réalisée en triplicata (moyenne ± SEM du triplicata) où le temps d’incubation est de 24 h.
Suite à ces études pilotes, nous avons sélectionné la carnitine, la combinaison de carnitine et de propionate (pour mimer l'effet potentiel du PLC) ainsi que la combinaison de carnitine, de propionate et de MB comme agents thérapeutiques.