Chapitre 3 : Culture cellulaire et évaluation biologique
2. Résultats
2.1. Étude de la morphologie cellulaire
Les images MEB ont été faites aux jours 21, 28 et 35 (Annexe 5).
L’échantillon PS présente de nombreuses cellules à sa surface (Figure 56). Ces dernières
sont adhérentes, aplaties avec des extensions cytoplasmiques et croissent entre le 21e et
35e jour. On note quand même un ralentissement après le 28e jour. Le tapis cellulaire est
relativement dense avec de la MEC. Cet échantillon présente cependant une pénétration cellulaire faible avec une évolution quasi nulle entre les jours 21 et 35. En effet on retrouve les cellules au niveau des premières couches de pores. Seules des cellules isolées sont présentes au cœur de la structure. La matrice en surface et, dans une moindre mesure, celle à l’intérieur du réseau poreux sont en cours de minéralisation (présence de nodules de minéralisation dès le jour 21) (Figure 56.E et D, flèche orange). En plus des nodules, on note la présence de structures qui apparaissent progressivement au cours du temps : ces derniers semblent être issus d’un phénomène de dissolution/précipitation (Figure 56.E, flèche rouge).
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Figure 56. Micrographies MEB de l’échantillon PS : (A) 21e jour surface ; (B) 28e jour surface ; (C) 35e jour surface, (D) 21e jour nodules de minéralisation, (E) 21e jour coupe transversale avec cellules, nodules de minéralisation (flèche orange) et précipitât (flèche rouge) et (F) 21e jour, pénétration cellulaire très limitée
Les échantillons 3D semblent avoir une population cellulaire beaucoup plus dense que les autres échantillons (Figure 57). Les cellules observées sont adhérentes et présentent des extensions cytoplasmiques. Une majorité de ces dernières s’oriente en fonction des sillons parallèles que l’on trouve en surface. On note sur le cliché pris au microscope confocal des cellules immunomarquées préférentiellement dans les sillons de l’échantillon (Figure 58). Les noyaux sont marqués au DAPI ou 4',6-diamidino-2-phenylindole et apparaissent en bleu alors que les filaments d’actine, en rouge, sont marqués par la phalloïdine. On voit aussi sur ces clichés l’orientation des filaments d’actine selon les rainures. Il semblerait que le cytosquelette s’est adapté à la topographie de l’échantillon. Cette population se densifie au
jour 28 et ce jusqu’au 35e jour. Il est important de noter que certaines porosités sont
occultées par un tapis cellulaire continu. Ce dernier semble se développer de façon
A B C D E F 1 mm 40 µm 500 µm 20 µm 10 µm 500 µm
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préférentielle mais pas exclusive au niveau des angles aigus des porosités. La pénétration cellulaire est plus importante que l’échantillon PS, mais les cellules que l’on retrouve dans la structure sont relativement éloignées les unes des autres et ne forment pas de tapis cellulaire continu. On retrouve, en surface et au sein des porosités, une matrice extracellulaire en cours de minéralisation à partir du jour 21. Contrairement aux autres échantillons, on note l’absence de structure faisant penser à un précipitât.
Figure 57. Micrographies MEB de l’échantillon 3D : (A) 21e jour, surface avec de nombreuses cellules
orientées ; (B) 28e jour, surface avec croissance du tapis cellulaire; (C) 35e jour, tapis cellulaire dense en surface (D) 21e jour nodules de minéralisation (flèche), (E) 21e jour, coupe transversale montrant un pore
en forme d’entonnoir dont le haut est obstrué par une couche de cellule et de MEC et (F) 21e jour,
présence de cellules dans le réseau poreux
A B C D E F 1 mm 1 mm 1 mm 10 µm 200 µm 200 µm
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Figure 58. Image prise au microscope confocal de CSMH immunomarquées sur un échantillon 3D au 14e
jour
L’échantillon CO1 présente des cellules adhérentes et quelques débris. La population cellulaire se densifie entre les jours 21 et 28. Cette dernière n’évolue que très peu au jour 35, toutefois il semble que la couche cellulaire en surface soit plus dense. Ceci est probablement
dû à une légère croissance cellulaire et une production de MEC au-delà du 28e jour. Les
cellules observées sont adhérentes et présentent de nombreuses extensions cytoplasmiques. La pénétration cellulaire est très bonne et bien supérieure à celle des échantillons 3D et PS. On retrouve des cellules à l’intérieur des pores et sur toute la hauteur de l’échantillon. On y retrouve des populations cellulaires denses avec de la MEC en cours
de minéralisation dès le 21e jour (Figure 59.B, flèche orange). À la surface du matériau, on
note l’apparition de structures résultant du phénomène de dissolution/précipitation (Figure 59.D, flèche rouge).
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Figure 59. Micrographies MEB de l’échantillon CO1 : (A) 21e jour coupe transversale ; (B) 21e jour nodules
de minéralisation (flèche orange) ; (C) 35e jour surface pores obstrués par un enchevêtrement de cellules
et de MEC et (D) 35e jour présence de précipitât (flèche rouge)
L’échantillon CO4 présente une bonne couverture cellulaire en surface. Ces dernières sont adhérentes et possèdent de nombreuses extensions cytoplasmiques. Contrairement à CO1, les débris sont moins nombreux. Entre les jours 21 et 28, la population cellulaire croît. Comme l’échantillon CO1, CO4 présente une couche cellulaire qui semble s’être densifiée
légèrement au 35e jour. La pénétration cellulaire est excellente puisque l’on retrouve un tapis
cellulaire (Figure 60) sur toute la hauteur des échantillons. On y retrouve aussi une matrice extracellulaire en cours de minéralisation par les cellules. Des nodules sont observés dès le
21e jour (Figure 60.C, flèche orange). On remarque aussi de nombreuses cellules pontant les
parois de pore (Figure 60.D) et la présence croissante de structures résultant du phénomène de dissolution/précipitation (Figure 60.F, flèches rouges).
A B
C D
100 µm 20 µm
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Figure 60. Micrographies MEB de l’échantillon CO4 : (A) : 21e jour surface, (B) 21e jour coupe transversale montrant l’invasion cellulaire (C) 21e jour nodules de minéralisation (flèche orange), (D) 28e jour coupe transversale cellule pontant les parois du pore, (E) 28e jour surface avec cellules et MEC et (F) 21e jour, coupe transversale avec cellules, nodules de minéralisation (flèche orange) et précipitât (flèche rouge)
Les performances de CO7 sont très réduites vis-à-vis des autres échantillons. Des cellules sont présentes à la surface mais en nombre plus faible que pour les autres échantillons. Ces dernières semblent être adhérentes et présentent des extensions cytoplasmiques. Il est important de noter que le nombre de cellules est très faible et cela est probablement dû au nombre élevé de débris observé (Figure 61.D). Malgré une étape de lavage après la
découpe, les débris n'ont pu être éliminés de façon efficace. Les premières images MEB (21e
jour) ne nous permettent pas d’affirmer s’il y a eu pénétration cellulaire ou pas. Et cette dernière ne semble pas évoluer au cours du temps. Par contre des nodules de minéralisation sont présents en surface. L’échantillon CO7 est le seul échantillon à présenter des structures en épine. Elles n’ont pas encore été identifiées mais sont certainement le résultat d’un
A B C D E F 1 mm 1 mm 200 µm 40 µm 20 µm 20 µm
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phénomène de dissolution/précipitation différents des autres types d’échantillon. L’une des causes probables serait l’abondance de débris sur et dans l’échantillon. Cet échantillon
connait une croissance cellulaire tardive. Au 35e jour, un tapis cellulaire recouvre une bonne
partie de la surface de l’échantillon et même certains pores.
Figure 61. Micrographies MEB de l’échantillon CO7 au: (A) 21e jour surface de l’échantillon avec débris et
très peu de cellule visible, (B) 21e jour nodule de minéralisation (flèche orange), structures en épines (flèche rouge) et nombreux débris (C) 35e jour surface de l’échantillon et (D) échantillon (sans cellules)
après découpage et rinçage, de nombreux débris sont présents et bloquent les pores
Tous les échantillons ont à leur surface et à l’intérieur de leurs réseaux de pores, des cellules avec ce qui semble être de la matrice extracellulaire. On observe aussi sa
minéralisation progressive: des nodules de minéralisation sont présents dès le 21e jour. Les
populations cellulaires des échantillons 3D, PS, CO1 et 4 croissent régulièrement jusqu’au
28e jour environ et leurs activités semble ralentir par la suite. Les échantillons congelés, à
l’exception de CO7, sont extrêmement favorables à la pénétration cellulaire, et ce dès le 21e
jour. L'impact de l'architecture sur la façon dont les échantillons ont été colonisés est visible puisqu'on note des cellules qui s'alignent sur la surface texturée de 3D alors que certaines dans CO1 et 4 sont tendues entre les parois de pore et solidement accrochées aux rugosités. Le phénomène de dissolution/précipitation peut être observé sur tous les échantillons sauf 3D. Le précipitât prend plutôt une forme globulaire sur les échantillons PS et CO1 et 4. Il semblerait que dans le cas de CO7, l’abondance de débris et, conséquemment, la haute surface spécifique sont à l’origine d’un phénomène de
B A C D 10 µm 500 µm 500 µm 260 µm
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dissolution/précipitation différent de celui rencontré chez les autres échantillons ce qui explique ces structures épineuses.
Les observations faites au MEB montrent clairement un comportement cellulaire qui diffère en fonction des échantillons. On note aussi des modifications du matériau qui semblent aussi être liées à l'architecture macroporeuse.