3.1. Introduction
Le pollen des Graminées constitue un des vecteurs majeurs d’aéroallergènes dans le monde. Les allergies respiratoires au sens large - incluant donc aussi bien l’asthme que les rhinites allergiques - représentent un problème majeur de santé publique, en particulier dans les pays du monde occidental.
Le pollen de fléole des près a été choisi dans cette étude, parce qu’il est représentatif des autres types de pollen de Graminées fourragères et céréalières.
De plus, quelques travaux ont montré que certaines caractéristiques du pollen évoluent au cours du temps, par exemple au niveau de sa capacité de germination et de sa résistance à un choc osmotique. Pour cela, dans un premier temps, une étude comparative entre 3 lots de pollen de fléole des près a été réalisée. Les lots utilisés sont les suivants : 2 lots commercialisés ayant subi un traitement post-récolte (P-2003, P-2005 ; Allergon) et un lot de pollen frais de la récolte 2006 n’ayant subi aucun traitement (P-2006 ; Allerbio). Au vu des différents résultats obtenus entre le pollen commercialisé et le pollen frais, en matière d’allergénicité et de libération des granules cytoplasmiques de pollen ou GCP, il nous a semblé préférable de travailler avec du pollen frais, afin de pouvoir se rapprocher au mieux des conditions environnementales (cf. Annexe 2).
L’allergénicité des GCP n’a été jusqu’alors que relativement peu étudiée aussi bien en France qu’à l’étranger. Il a donc paru fondé de vérifier certaines hypothèses proposées par différents auteurs et notamment celles, directement dans notre groupe, d’Alexandre Motta pour tenter de compléter et d’élargir ce qui avait déjà pu être réalisé et mis à jour dans sa thèse (2004). Les critères de choix des concentrations de GCP servant pour les instillations pratiquées sur les rats BN n’ayant pas été explicitement exposées, nous avons souhaité, dans la présente étude menée à partir de 2006, aborder cet aspect sous un angle rendant possible, relativement facilement et terme à terme, la comparaison entre grain de pollen et GCP. Ainsi, ce sont des quantités initiales pondérales équivalentes de GCP et de pollen, soit 0,5 mg/animal, qui ont été utilisées pour instiller les rats. La quantité particulaire, utilisée par ailleurs, de 4.5 x 107 GCP/rat correspond, quant à elle, à la quantité de granules libérées si 100% des
de GCP ont été prises en compte. Elles correspondent respectivement aux cas où 33% et 3% des grains de pollen ont explosé au moment du choc osmotique.
D’autre part, s’agissant de la taille moyenne des GCP, afin d’obtenir des mesures plus fines que celles disponibles jusqu’alors, un compteur de particules plus sensible a été utilisé. Au lieu de se baser seulement sur un spectre moyen de diamètre situé entre 2 et 5 !m, nous avons pu étendre la mesure vers des diamètres beaucoup plus petits, la largeur du spectre étant maintenant comprise entre 0,6 et 5 !m. Avec cette nouvelle série de mesures, il apparaît clairement que les tailles les plus petites sont celles qui sont les plus représentées.
Les expérimentations précédentes n’avaient pas abordé un autre aspect qu’il nous a paru important de mettre en avant, à savoir une comparaison entre pollen et GCP en s’appuyant sur un même protocole pour l’utilisation des deux sources allergéniques. Ceci peut permettre de mieux évaluer l’allergénicité de chacun des composants en évitant des biais méthodologiques. À partir de l’ensemble de ces propositions de travail, un premier article intitulé « Effects of pollen grains and their cytoplasmic granules on allergic humoral and cellular responses in the rat » a été composé.
Comme, par ailleurs, aucun travail n’avait été encore réalisé in vivo pour essayer d’évaluer les effets conjugués du pollen et des GCP, nous avons abordé expérimentalement cette question en proposant un protocole spécifique.
Quatre groupes ont été étudiés : (1) rats sensibilisés au pollen et provoqués par les GCP, (2) rats sensibilisés par les GCP et provoqués par du pollen, (3) GCP seul et, finalement, (4) pollen seul (sensibilisation et provocation avec le même produit pour les deux instillations des groupes 3 et 4). Ce travail a fait l’objet de la deuxième publication dont le titre est : « About the allergenic potential of Phleum pratense pollen cytoplasmic granules: new elements from a Brown Norway rat model ».
Dans nos 2 premières études, afin d’éliminer la plus grande quantité possible d’allergènes hydrosolubles provenant du pollen entier, les GCP ont été lavés. Mais, nous avons pensé que dans des conditions non-expérimentales, en environnement extérieur, des GCP contenant ou dépourvus d’allergènes hydrosolubles - GCP non-lavés et GCP lavés respectivement - peuvent être présents dans l’atmosphère, ceci en fonction des effets potentiels des précipitations. De même, bien que la majorité des études concernant la réaction allergique
également en compte les allergènes non-hydrosolubles puisqu’ils semblent être souvent impliqués dans la réaction allergique. Pour cela, une étude évaluant les potentiels allergique et inflammatoire des GCP lavés et GCP non-lavés a été effectuée en utilisant le même modèle animal d’allergie au pollen, le rat Brown Norway. Trois groupes ont été étudiés : (1) rats sensibilisés et provoqués par les GCP lavés, (2) rats sensibilisés et provoqués par les GCP non-lavés, et, finalement, (3) rats sensibilisés et provoqués par du pollen. De plus, dans cette même étude, une première phase d’identification des allergènes hydrosolubles et non- hydrosolubles de GCP et de pollen a été menée en utilisant des sérums de rats sensibilisés. Ce travail a permis la construction d’un troisième article portant le titre suivant : « Role of water- soluble and water-insoluble allergens of pollen cytoplasmic granules in humoral and cellular allergic responses ».
De plus, une mise au point d’un nouveau modèle animal d’allergie au pollen permettant d’étudier un éventuel effet adjuvant de polluants atmosphériques a été réalisé au cours de ce travail (cf. Annexe 3).
L’allergénicité des différentes sources d’allergènes concernaient les réponses humorales et cellulaires de l’allergie et de l’inflammation chez les rats. Ces réponses ont été évaluées par différents paramètres :
• taux d'IgE et IgG1 dans le sérum ;
• pourcentage d'éosinophiles et concentrations des cytokines Th2 (IL-4, IL-5, IL-13 et Rantes), médiateurs de l'allergie dans le liquide bronchoalvéolaire (LBA) ;
• prolifération spécifique - pour le pollen ou les GCP - des lymphocytes ganglionnaires (mesure de l’incorporation de thymidine tritiée en cpm) ;
• nombre et cytologie (coloration des frottis cellulaires au May Grunwald Giemsa) des cellules - macrophages, lymphocytes, neutrophiles et basophiles - dans les LBA ;
• intégrité de la barrière alvéolo-capillaire (protéines totales dans les LBA) et concentrations des cytokines Th1 (IL-1 ; IL-2, IFN!, TNF"…) médiateurs de l'inflammation dans les LBA.