Étude du comportement chromatographique des molécules bioactives

4-1- Chromatographie sur papier

La technique réalisée est une chromatographie ascendante. Le papier utilisé est du papier Whatman N°1. Les extraits organiques des différentes souches étudiées (200µl de chaque extrait) sont déposés à 3 cm du bord inférieur du papier en plusieurs fois sous forme de spots à l’aide d’un capillaire. Chaque application est suivie par séchage à air froid pour donner la plus petite surface possible au dépôt. La cuve à chromatographie est saturée en vapeurs du solvant pendant deux heures avant d’introduire les feuilles de papiers dont le bord est immergé à une profondeur d'1 cm dans la phase mobile.

Les différents systèmes de solvants utilisés sont :

- Système toluène saturé

79 - Système éther de pétrole

- Système butanol saturé

- Système butanol -méthanol (1 :1) - Système toluène -cyclohexane (1 :1) - Système toluène -méthanol (1 :1) - Système toluène -chloroforme (1 :1)

- Système toluène -éther de pétrole- acétone (20 :5 :10)

La chromatographie est arrêtée lorsque le front du solvant a parcouru une distance de 15 cm à partir du point de dépôt. Le solvant est éliminé par évaporation à température ambiante avant de passer à la révélation des chromatogrammes.

4-1-1- Révélation par les vapeurs d’iode

Les molécules bioactives sont révélées sur le papier en utilisant les vapeurs d’iode : 10 à 20 grammes de cristaux d’iode sont introduits dans une cuve parfaitement étanche et sont laissés une période suffisante pour saturation complète de la cuve, les chromatogrammes sont ensuite introduits pendant quelques minutes. Après avoir retiré le papier, l’iode sublime rapidement et les emplacements des molécules bioactives se colorent en brun. Leurs rapports frontaux (Rf) sont calculés d’après la relation :

Distance parcourue par les molécules bioactives Distance parcourue par le front du solvant

4-1-2- Révélation microbiologique des chromatogrammes

Les chromatogrammes sont coupés en bandes de 1 cm de largeur et déposés sur la surface d’un milieu Mueller-Hinton gélosé préalablement ensemencé par une bactérie-test. Les boites sont placées à +4°C pendant deux heures et les zones d’inhibition sont notées après incubation à 37°C pendant 24 à 48 heures.

4-2- Chromatographie sur couche mince

Des plaques de gel de silice « 60F254 » sur support d’aluminium, prêtes à l’emploi, ont été utilisées. 200µl des extraits sont déposés progressivement, à l’aide de capillaire sous forme de spots à 1,5 cm du bord inférieur de la plaque avec séchage entre chaque

80

application. Les cuves rectangulaires utilisées contiennent 100ml de solvants. L’atmosphère des cuves est saturée pendant deux heures avec les vapeurs de solvants cités ci-dessous, avant d’introduire les plaques de silice.

Les systèmes de solvants utilisés sont : - Système butanol saturé

- Système butanol-acide acétique-eau (3 :1 :1) - Système butanol-méthanol (1 :1)

- Système toluène-cyclohexane (1 :1) - Système toluène saturé

- Système toluène-méthanol (1 :1) - Système toluène-acétone (6 : 4)

- Système toluène-acide acétique (8 : 2).

La chromatographie est arrêtée lorsque le front du solvant a parcouru une distance de 10 cm à partir du point de dépôt. Après élimination du solvant, les chromatogrammes sont observés sous lumière UV (λ = 254 et 365 nm). Les spots qui apparaissent sont grattés et déposés à la surface du milieu Mueller Hinton ensemencée avec la bactérie-test pour mettre en évidence leur activité antibactérienne. Après pré-diffusion à +4°C et incubation à 37°C pendant 24 à 48 heures, les Rf des spots présentant une activité sont calculés.

Résultats et discussion

1- Étude de la solubilité des substances bioactives

1-1- Extraction à partir de milieu liquide

Les résultats obtenus avec l’extrait à l’acétate d’éthyle du surnageant de la culture de la souche S1 ne présente aucune activité cellulaire sur toutes les bactéries-tests utilisées. En revanche, l'activité antibactérienne apparaît avec l’extrait butanolique et l’extrait au toluène. Dans ce dernier, elle est plus importante. Par ailleurs, l’extrait méthanolique du mycélium ne montre qu’une faible activité contre B.cereus (Figure 36).

L’apparition de l’activité antibactérienne dans un solvant polaire (le butanol) et un autre apolaire (le toluène), suppose qu’il s’agit soit de plusieurs molécules de polarité différente (soluble chacune dans un solvant différent) ou bien une ou plusieurs molécules

81

solubles dans des solvants variés. Cette dernière hypothèse est plus probable puisque selon Guernet et Hamon (1981), les antibiotiques dont la structure est généralement complexe comprennent des caractères polaires et apolaires entrainant une affinité pour des solvants très divers.

À l’exception de l’extrait butanolique, il y’a absence totale d’activité antibactérienne dans les autres extraits organiques des surnageant des cultures de la souche S2 (Figure 37). Ces résultats laissent supposer, d'une part, la présence de molécules bioactives polaires et confirment d'autre part, les constatations faites dans le chapitre précédent. En effet, les activités sont conservées même après extraction.

1-2- Extraction à partir de milieu solide

Tous les extraits organiques étudiés des deux souches présentent des activités antibactériennes (Figures 38 et 39), ce qui montre que l’extraction à partir de milieu solide est largement plus rentable que celle du milieu liquide. En effet, la production d’antibiotiques à partir de milieu solide est généralement plus importante quantitativement et qualitativement que celle en milieu liquide. Il existe même des microorganismes producteurs d’antibiotiques sur milieu solide qui perdent cette capacité en milieu liquide (Shomura et al., 1979). Cette différence est due à la morphologie de la croissance dans les deux cas : en milieu liquide, les hyphes des Streptomyces fragmentent ce qui diminue leur capacité de produire des antibiotiques (Stocks et Thomas, 2001) et généralement la production d’antibiotiques est corrélée avec la taille des fragments mycéliens (Olson et Ratzkin, 1999), cette fragmentation en milieu liquide peut être évitée sur milieu solide. Ceci explique les grands diamètres d’inhibition obtenus dans le test de mise en évidence et qui ne sont retrouvés qu’après extraction à partir de milieux solides. D’ailleurs plusieurs chercheurs ont utilisé les milieux solides pour faciliter les différentes étapes d’études de la production d’antibiotiques par les Streptomyces comme Bussari et al. (2008).

82

Figure 36. Activité des extraits organiques du milieu liquide de la souche S1.

Figure 37. Activité des extraits organiques du milieu liquide de la souche S2. (mm)

83

Figure 38. Activité des extraits organiques du milieu solide de la souche S1.

Figure 39. Activités des extraits organiques du milieu solide de la souche S2. S.aureus

84

En se basant sur ces résultats, notre travail d'analyse s'est poursuivi sur les extraits suivants :

- extrait à l’acétate d’éthyle à partir de milieu solide de la souche S1, - extrait à l’acétate d’éthyle à partir de milieu solide de la souche S2, - extrait au toluène à partir de milieu liquide de la souche S1,

- extrait à l'acétone à partir de milieu solide de la souche S2.